Technische Universität Dresden Chemosensitivierung von Harnblasenkarzinomzelllinien mittels hTERT- Antisense-Oligonukleotiden Kai Kraemer*, Susanne Fuessel, Uta Schmidt, Axel Meye, Manfred P. Wirth Universitätsklinikum Carl Gustav Carus, Klinik und Poliklinik für Urologie Technische Universität Dresden http://urologie.uniklinikum-dresden.de, *e-mail: titabo@gmx.de Einleitung Herkömmliche Chemotherapeutika (CT) wie Mitomycin C (MMC), Cisplatin (CDDP) und Gemcitabin (GEM) bewirken oft nicht die erhofften Behandlungserfolge gegen das Harnblasenkarzinom (BCa). Ein Hauptproblem stellt die hohe Rezidivrate (50% innerhalb von 2 Jahren nach Resektion) dar. Außerdem treten häufig Resistenzen gegenüber CT auf. Aufgrund seiner tumorspezifischen Expression sowie seiner Funktion im Immortalisierungs- und Tumorgeneseprozess erscheint hTERT als geeignetes Antitumor-Target. hTERT schützt die Telomere vor Abbau und stabilisiert somit das Genom1. Die tumorinhibitorische Effizienz von gegen hTERT gerichteten Antisense-Oligodesoxynukleotiden (AS-ODN) als Einzelbehandlung konnte in Vorstudien gezeigt werden2. Ziel dieser Arbeit war es, eine mögliche Verstärkungswirkung von MMC, CDDP und GEM durch eine Kombination mit hTERT AS-ODN zu untersuchen. Abb.2 hTERT-mRNA Expression in BCa Zelllinien und Fibroblasten (FB). Die hTERT-Transkriptmengen wurden auf das Referenzgen PBGD bezogen. Abb.4 Verlängerte Verdopplungszeiten von EJ28- Zellen nach AS+CT- Behandlung. Ergebnisse Alle untersuchten BCa-Zelllinien zeigen eine hTERT-mRNA-Expression auf unterschiedlichem Niveau im Gegensatz zu nicht-malignen humanen Fibroblasten (FB) ohne hTERT-Expression (Abb.2). Eine konzentrationsabhängige Viabilitätsreduktion durch Behandlung mit MMC, CDDP bzw. GEM wurde in allen BCa-Zelllinien nachgewiesen. Eine AS+CT-Behandlung in relativ geringer CT-Konzentration reduzierte die Viabilität in stärkerem Maße als eine AS-ODN-Einzelbehandlung in allen Zelllinien außer in ASt2331-behandelten J82 (Abb.3). Eine AS+CT-Behandlung zeigte eine signifikant verstärkte Inhibition im Vergleich zur NS+CT-Kontrolle in der Mehrheit der Fälle, was auf einen spezifischen hTERT-vermittelten Effekt schließen lässt. Keine spezifische Verstärkung unabhängig von der verwendeten CT-Konzentration konnte in AS+CDDP-behandelten RT112-Zellen sowie in ASt2331+GEM-behandelten J82-Zellen gezeigt werden (Abb.3). Eine AS+CT-Behandlung bewirkte außerdem verlängerte Verdopplungszeiten in EJ28-Zellen (Abb.4). Jede AS+CT-Kombination führte zu einer erhöhten Apoptoserate im Vergleich zur NS+CT-Kontrolle in EJ28-Zellen (Abb.5). Die Apoptose war mit einer Caspase-3-Aktivierung assoziiert (Abb.6). Diskussion Die Verstärkung der CT ist unabhängig von der initialen hTERT-Expression in den verschiedenen Zelllinien. Sowohl EJ28-Zellen (starke hTERT-Überexpression) als auch 5637-Zellen (moderate Überexpression) wurden in ähnlicher Weise gegenüber CDDP, GEM und MMC sensitiviert. In RT112-Zellen, in denen keine AS-ODN-Effekte als Einzelbehandlung nachweisbar waren, konnten die Wirkungen von MMC und GEM signifikant verstärkt werden. Eine zusätzliche AS-ODN-Transfektion könnte die Tumorspezifität der Anti-BCa-Behandlung erhöhen. Die Eignung der AS-ODN-Kombinationstherapie in vivo soll in Tierexperimenten überprüft werden. Der Verstärkungseffekt dieser kombinierten Therapie könnte eine Dosisreduktion der CT erlauben und somit zu verringerten Nebenwirkungen führen. Abb.3 Effekte einer Kombinationsbehandlung auf die Viabilität von BCa-Zelllinien. Die NS-K1-Kontrolle repräsentiert 100%. Für jede Zelllinie wurden zwei CT-Konzentrationen verwendet. CDDP: EJ28, 5637, RT112  1.0/2.0µg/ml; J82  0.5/1.0µg/ml; MMC: EJ28  0.33/0.67µg/ml, J82  0.67/1.34µg/ml, 5637  0.33/1.0µg/ml, RT112  1.0/1.67µg/ml; GEM: EJ28  1.0/2.5ng/ml, J82  4.0/5.5ng/ml, 5637  2.0/4.0ng/ml, RT112  2.5/4.0ng/ml. Fehlerbalken kennzeichnen die Standardabweichungen von Vierfachbestimmungen. Signifikante Unterschiede zwischen AS+CT und NS+CT (* p0.05, ** p0.01, *** p0.001) werden durch Sterne gekennzeichnet. Material & Methoden Die hTERT-Expression wurde mittels LightCycler TeloTAGGG hTERT Quantification Kit (Roche) bestimmt. Die CT-Konzentrationen wurden an jede Zelllinie (EJ28, 5637, J82, RT112) angepasst, um eine moderate Viabilitätsinhibition zu erreichen (Abb.3). Die lipofectinvermittelte Transfektion der Zellen erfolgte mit 250nM AS-ODN bzw. Nonsense (NS)-ODN. Nach 24h erfolgte die Inkubation mit CDDP (24h), GEM (24h) oder MMC (2h; Abb.1). Die Viabilität wurde mittels WST-1-Test (Roche) gemessen. Signifikante Unterschiede zwischen den AS+CT-Kombinationen und den NS+CT-Kontrollen wurden mittels Student’s T-Test berechnet. Die Apoptoserate wurde per Annexin V–Propidium Iodid (PI)-Markierung und FACS (BD Biosciences) bestimmt. Zur Bestimmung einer Caspase-3-Aktivierung wurde die Procaspase-3 (32kDa) sowie deren Spaltprodukt (11kDa) mittels Western Blot nachgewiesen. Die Verdopplungszeiten wurden nach folgender Formel berechnet: DT=Zeit X/[log(nX/n0)/log2], wobei nX und n0 die Zellzahlen zu den Zeitpunten X und 0 darstellen. Referenzen 1 Sharma, G. G., Gupta, A., Wang, H., Scherthan, H., Dhar, S., Gandhi, V., Iliakis, G., Shay, J. W., Young, C. S., and Pandita, T. K. (2003). hTERT associates with human telomeres and enhances genomic stability and DNA repair. Oncogene 22, 131-146. 2 Kraemer, K., Fuessel, S., Schmidt, U., Kotzsch, M., Schwenzer, B., Wirth, M. P., and Meye, A. (2003). Antisense-mediated hTERT inhibition specifically reduces the growth of human bladder cancer cells. Clin Cancer Res 9, 3794-3800.   Abb.5 Verstärkte Apoptoseinduktion durch AS+CT Behandlung in EJ28-Zellen. Die Prozentwerte für frühapoptotische Zellen (Annexin V-positiv, PI-negativ; unten rechts) und spätapoptotische bzw. tote Zellen (Annexin V-positiv, PI-positiv; oben rechts) sind innhalb der Quandranten angegeben. Abb.1 Behandlungsschema von BCa-Zellen in vitro. Abb.6 Aktivierung der Caspase-3. Durch Spaltung der Procaspase-3 (32kDa) entsteht die aktive Form (11kDa).