Ergebnisse des Praktikums an der WWU Glückwunsch! Bei (fast) allen Gruppen hat die PCR geklappt (so hoch ist die Trefferquote in den Studenten-Praktika zumeist nicht…) Die DNA-Isolierung hat auch in den meisten Ansätzen zum erwarteten Ergebnis geführt

PCR Ergebnisse: PCR Gr. ∆ PCR Gr. X M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 Großes Gel Kleines Gel M = Marker (Hyper-Ladder)

DNA Isolierung M ☺ ☺ ∆ ∆ X X 1 1 M = Marker (Hyper-Ladder) T D T D T D T D M = Marker (Hyper-Ladder) T = Tomaten-DNA D = Drosophila-DNA

Zur Auswertung: PCR: DNA-Isolierung: Warum ist ausschließlich in Ansatz 3 eine Bande zu sehen? Die Primer waren spezifisch für ein Gen in Drosophila (Annexin X) und konnten demnach nicht an die Tomaten-DNA binden. Ein Primer ist nicht ausreichend für die spezifische Amplifizierung eines DNA-Fragmentes definierter Größe, so dass in Ansatz 1+2 keine Banden zu sehen sind. Gruppe “Dreieck“ hat möglicherweise beim Auftragen Probe 3 und 4 vertauscht oder aber bereits beim Ansetzen der PCR falsch beschriftet oder das falsche Template eingesetzt. Wie groß (in bp) ist das amplifizierte DNA-Fragment? Schwarzer Pfeil; vgl. Marker-Abbildung; etwas 530 bp Worauf deutet der blaue Pfeil neben dem großen Gelen mit den PCR-Ansätzen? Dies sind die eingesetzten Primer (auch Nukleinsäuren, daher ebenfalls mit Ethidiumbromid zu visualisieren, die in Ansatz 3+4 in doppelt so hoher Konzentration vorliegen, wie in Ansatz 1+2). DNA-Isolierung: Hat bei allen Gruppen generell geklappt. (Bei der Gruppe „Smilie“, wurde bei der Tomaten-DNA vermutlich das Pellet versehentlich mit abpipettiert; bei Gr. „Eins“ sind die DNA-Konzentrationen insgesamt recht gering.) Wie groß sind die isolierten DNA-Moleküle? Die genaue Größe kann nicht bestimmt werden, liegt aber deutlich über 10 kb, was auch zu erwarten ist, wenn bei der Isolierung vorsichtig gearbeitet wurde und die DNA-Moleküle nicht zerrissen wurden. Der „Schmier“ bei der Drosophila-DNA in einigen Ansätzen ist ein Beispiel für etwas zu große Scherkräfte bei der Isolierung und die partielle ‚Zerstückelung‘ der DNA in viele unterschiedliche lange DNA-Fragmente, die dann als Schmier im Gel zu sehen sind. Was könnten die Banden sehr weit unten im Gel (Pfeil unten) sein (kleine DNA-Fragmente)? Mit den im Kurs angewendeten chemischen Methoden werden Nukleinsäuren isoliert, also DNA und RNA. Die RNA ist deutlich kleiner als 200 bp. Wie könnte die RNA aus den Proben entfernt werden um reine DNA zu erhalten? Einfache biochemische Methode: Enzym RNAse, dass spezifisch RNA abbaut.