Möglichkeiten und Grenzen von MALDI-MS Fingerprints am Beispiel der Strukturaufklärung eines Membranproteins von Pseudomonas fluorescens G173 Diana Uría Fernández 1 , Mathias Schäfer 1, Herbert Budzikiewicz 1, Sabine Waffenschmidt 2, Sabina Heim 3 1 Institut für Organische Chemie, Universität zu Köln, Deutschland 2 Institut für Biochemie, Universität zu Köln, Deutschland 3 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung, Abteilung für Mikrobiologie, Braunschweig, Deutschland Bakterienkulturen des Stammes Pseudomonas fluorescens Köln-G173 wurden auf Minimalmedium parallel unter Eisenmangel-Bedingungen (-KG173) und in einem eisenhaltigen Medium gezüchtet (+KG173) (Ab- bzw. Anwesenheit von Eisencitrat im Medium). Durch die speziellen Wachstumsbedingungen unter Eisenmangel (-KG173) sollen die für den Siderophor-vermittelten aktiven Eisentransport in die Zelle verantwortlichen äußeren Membranproteine überexprimiert werden. Die äußeren Membranproteine können durch Anwendung von kombinierten Methoden nach Standardprotokoll isoliert werden. Anschließend wurden die Proteine der –KG173 und +KG173 Züchtung mittels SDS-PAGE fraktioniert und die elektrophoretischen Ergebnisse verglichen. Im Fall von –KG173 konnte bei  80 kDa eine signifikante Proteinbande identifiziert werden, mutmaßlich ein IROM-Protein (Iron Rezeptor Outer Membrane Protein), das bei Eisenmangel-Wachstumsbedingungen deutlich stärker produziert wurde (Abb. 1). Nach Erkennung des IROMPs wurde die entsprechende Gel-Bande ausgeschnitten und tryptisch verdaut. Trypsin spaltet die Peptidkette spezifisch nach Arginin und Lysin, es sei denn, auf Arg bzw. Lys folgt Phe. Die tryptischen Verdau-Peptide wurden mittels MALDI-MS analysiert (Abb. 2). Mit diesem "peptide mass fingerprint" wurde eine Datenbanksuche (10 ppm m) durchgeführt. Diese Datenbanksuche blieb erfolglos ! Vergleicht man die theoretisch zu erwartenden tryptischen Verdau-Peptide von Ferripyoverdin-Siderophor-Rezeptoren von P. aeruginosa und P. putida, (Organismen mit aufgeklärtem Genom bzw. bekannter Primärstruktur der IROMPs) so kann man keine Übereinstimmung der "peptide mass fingerprints" feststellen. Also haben die IROMPs von P. aeruginosa und P. putida keine konservierten Domänen und damit ist letztlich nur die Sekundärstruktur der Proteine entscheidend für die Funktion der Rezeptoren. Daraus folgt, daß für die Identifizierung des isolierten Membranproteins Informationen über die Aminosäuresequenz gewonnen werden müssen. Durch tandem-massenspektrometrische Product-Ion-Experimente an einem Q-TOF mit nano-ESI-Ionenquelle wurde eine erfolgreiche As-Sequenzierung von drei Verdau-Peptiden von P. fluorescens G173 möglich (Abb. 3; Schema 1). Anhand der Aminosäuresequenzen der drei untersuchten Verdau-Peptide liefert die Datenbankrecherche für das isolierte Protein eine sehr weitreichende Homologie mit der Aminosäuren-Sequenz des Hämrezeptors von Pseudomonas aeruginosa. Der Vergleich mit anderen Häm- und Ferripyoverdin-Rezeptorproteinen zeigt, daß diese Proteine eine ähnliche dreidimensionale Struktur haben. Ihnen ist ein sogenanntes -Faß-Protein gemein, das aus ca. 20 -Falten-Trans-Membransegmenten aufgebaut ist. Dieses -Faß-Protein besteht ausschließlich aus hydrophoben Aminosäuren und befindet sich innerhalb der äußeren Membran. Aus ihm ragen mehrere -Helix-Loops heraus, die für die Erkennung und Bindung des Siderophors verantwortlich sind. 84 kDa 66 kDa -KG 173 Standard +KG173 -KG 173 +KG173 -KG173 +KG173 -KG173 Abb. 1 SDS-Gel der Membranproteine Pseudomonas fluoreszens Köln-G173 -KG173 : Züchtung unter Eisenmangel +KG173 : Züchtung mit Fe (Eisencitrat im Nährmedium) Abb. 2 MALDI-MS-Spektrum des IROMPs aus Pseudomonas fluoreszens -KG173; eingerahmte Ionen wurden mit nano-ESI-MS/MS einer Sequenzanalyse unterzogen. Abb. 3 nano-ESI-MS/MS-Produktionen-Spektrum von [M+2H]2+ bei m/z 681.25 ( 1361.58 [M+H]+); aus der vollständigen y“n-Serie folgt die As-Sequenz: wnnwtflpqr Schema 1: As-Sequenzen der drei tryptischen Fingerprint-Peptide, anhand charakteristischer Fragmentierungsmuster in nano-ESI-MS/MS. As-Sequenz des Hämrezeptors von P. aeruginosa und die As-Sequenzen der drei Fingerprint-Peptide aus der Membranpräparation von P. fluorescens -KG173. mplsppfalr pclallllsp slalagnavp ltpttitatr teqavdsvps tvsvqtreql rqnvnnike lvryepgvsv ggagqragit nqapglsv g gynirgidgn riltqidgve lpndffsgpy qthrnyvdp divkrveilr gpasalygsn aiggavsyft ldpsdiikdg kdvgarlkag esashswlt satvagradd fdgllhygyr qghetesngg hggtglsrse anpedadsys lgklgwnya egsrfglvfe kyksdvdtdq ksayggpydk gkpaippsml pggmyqwrkg ndtltreryg lehhfllds qvadriqwsln yqlaktdqat refyypitrk vlrtrdttyk glnas qvadp rlwvfdsql dksfaigete hllsyginlk hqkvtgmrsg tgtnldtgad sprdalerss dfpdptvkty alfaqdsisw ndwtftpglr w nnwtflpqr ydytrmephi tdeflrtmkq sqntavdesd kkwhrvspkf gvtydfaqhy twygqyaqgf rtptakalyg rfenlqagyh iepnpnlkpe ksqsfetglr gkfdegsfgv avfynkyrdf idedalntds tggngqtfqs nnieravikg velkgrlelg afgapqglyt qgsvayaygr nkdngepins vnpltgvfgl gydeadgnyg gllswtlvkr kdrvddstfh tpdgtasqfk tpgfgvldls ayyrlskdlt lnaglynltd kkywlwddvr gydsvgeasa lapanidrls qpgrnfavnl vwdi Vorläuferionen der abgeleitete As-Sequenzen nano-ESI-MS/MS Experimente m/z 2702.3 [M+H]+ nqapglsvg m/z 2815.09 [M+H]+ glnasqvadp m/z 681.25 [M+2H]2+ ( 1361.58 [M+H]+) wnnwtflpqr Experimenteller Teil: Zucht des Bakterienstammes Pseudomonas fluoreszens Köln-G173 erfolgte auf Minimalmedium (Kohlenstoffquelle und Nährsalze: Bernsteinsäure, (NH4)2SO4, MgSO4, K2SO4. Zur Überexpression der äußeren Membranproteine (IROMPs) wurde unter Eisenmangelbedingungen gezüchtet (-KG173). Die als Referenz in eisenhaltigem Medium gezüchteten Bakterienkulturen werden als +KG173 bezeichnet (Eisencitrat im Nährmedium). Isolierung der äußeren Membranproteine erfolgte durch Behandlung mit Lysozym bei 37°C, Zentrifugation und Dialyse gegen NaEDTA. Die Proteinkonzentration wurde schließlich mittels Mikro-Lowry UV/VIS-spektroskopisch bestimmt. SDS-Polyacrylamidelektrophorese (SDS-Page): Die äußeren Membranproteine aus P. fluorescens +KG173 und -KG173 wurden mit SDS-Page getrennt, nach Coomassie-Färbung konnte bei -KG173 eine signifikante Bande bei ca. 80 kDa beobachtet werden. Diese Bande wurde ausgestanzt, entfärbt und mit Trypsin behandelt. Nach Extraktion wurden die tryptischen Verdaupeptide massenspektrometrisch untersucht. Massenspektrometrie: MALDI-MS: Die MALDI-MS Untersuchungen des tryptischen Verdaus wurden an einem PE Biosystems Voyager-STR MALDI-RE-TOF Massenspektrometer durchgeführt (Matrix: -cyano-4-hydroxy-Zimtsäure 4-CHCA, Reflektron-mode, Auflösung:  10000). Die nano-ESI-MS/MS Experimente wurden an einem Micromass QTOF durchgeführt. Zusammenfassung: Wie die Studie zeigt, ist die erfolgreiche Identifikation eines Proteins auf Basis von MALDI-MS “peptide-mass-fingerprints” und nachfolgender Datenbankrecherche nicht immer möglich. Da Proteine mit sehr ähnlicher Funktion offensichtlich keinerlei Übereinstimmung in Ihren Primärstrukturen zeigen müssen, ist nicht zu erwarten, daß Enzyme oder Membranproteine artverwandter Organismen verwertbare d.h. eine Zuordnung ermöglichende “peptide-mass-fingerprints” liefern (siehe Rezeptor-Proteine von P. aeruginosa und P. putida). Somit ist ein erfolgreicher Einsatz von MALDI-peptide-mass-fingeprints nur bei Proteom-Analysen von Organismen zu erwarten, deren Genom und damit die Primärstrukturen der jeweiligen Proteine bekannt sind. Wie am Beispiel des IROM-Protein von P. fluorescens KG173 demonstriert, ist die tandem-massenspektrometrische Bestimmung der As-Sequenz der Verdau-Peptide von P. fluorescens KG173 Voraussetzung für eine Protein-Identifikation. Die weitreichende Homologie der As-Sequenz der Verdau-Peptide mit der des Häm-Rezeptor-Proteins von P. aeruginosa ermöglicht letztlich die Zuordnung.