Labor-Seminar 08.04.2008 Juliane Schmidt Und ganz viele Helfer! „Evaluierung und Validierung potenzieller molekulargenetischer Tumormarker in Urinproben von Patienten mit Verdacht auf Harnblasenkarzinom“

Einführung Epidemologie BCa: Diagnostik: B) invasiv: A) nicht-invasiv: Vierthäufigster Tumor beim Mann weltweit neunthäufigste Ursache eines tumorbedingten Todes Diagnostik: A) nicht-invasiv: B) invasiv: 1. Allgemein: 1.Speziell: Urinsediment Urincytologie Zystoskopie Sonographie

Zielstellung Etablierung standardisierter Methoden zur quantitativen Transkriptmessung in Geweben (TUR-Späne) und Urinproben Targetvalidierung an Gewebeproben (Tu-Tf) Evaluierung verschiedener tumorassoziierter Faktoren als mögliche diagnostische und prognostische BCa-Marker

BCa-assoziierte Gene Survivin & XIAP (“inhibitor of apoptosis proteins”) Ki67 NEU CK20 UCA1 hTERT

Material & Methoden 1 prospektive Studie: Februar 2006 – März 2007 (letzter “Primärurin”) Einschlusskriterien: Patienten mit Verdacht auf ein BCa, die sich einer transurethralen Resektion (TUR-BT) unterziehen Ausschlusskriterien: Patienten mit zusätzlichem Prostata-Ca Patienten mit gutartigen Veränderungen ( z.B.Papillom ) Patienten mit nicht-urothelialen Karzinomen (z.B.Adeno-Ca)

Material & Methoden 2 Kontrollgruppen: BPH-Patienten Cystitis-Patienten Gesunde

Material & Methoden 3 BCa-Patienten: Kontrollen: 1 Urinprobe prä-operative Urinprobe intra-operatives Gewebe (Tumor & optisch gesunde Blasenmucosa) post-operative Urinprobe (bis 11/06) für prim./sek./tert. TUR-BT/ Rezidive/ Cystektomie Kontrollen: 1 Urinprobe

Behandlungsverlauf eines Blasenkarzinompatienten Rezidiv Primäre TURBT ca. 6-8 Wochen Rezidiv Sekundäre TURBT Cystektomie ca. 6-8 Wochen Tertiäre TURBT Cystektomie

Material & Methoden 4 Sedimentation der Zellen aus dem Urin Gewebekryoschnitte (Tf = 0%, Tu = 70-100%) Isolation von total RNA und cDNA-Synthese quantitative PCR für Bca-Gene und das Referenzgen TBP in Urin- & Gewebeproben Korrelation der relative Expressionsniveaus von der BCa-Gene (interne Normalisierung auf TBP) mit klinisch-pathologischen Aspekten

BCa vs.Kontrollgruppen group BCa BPH cystitis healthy BT NT n 105 (85,37%) 18 (14,63%) 62 25 46 age* 71J. (22-93J.) 67,5J. (62-87) 32,5J. (18-88J.) 29J. (18-59) m:f 72:50 (59:41%) 1:24 (4:96%) 16:30 (34,8:65,2%) PSA* ng/ml 1,56 (0-33,91) 2,4 (0,05-16.85) *Mediane angegeben

TNM vs. Risk groups 17 1 29 60 76 26 18 50 TNM Grading Risk group (eau) pT0 17 (13,9%) NT pTis 1 (0,8%) G1 Low grade 29 (23,8%) Low risk pTa 60 (49,2%) G2 High grade 76 (62,3%) Intermediate risk 26 (21,3%) pT1 18 (14,8%) G3 High risk 50 (41%) >pT1

Risikogruppen (eau guidelines) bzgl.Rezidiv+ Progression Low-Risk Tumor Solitärer, kleiner (< 3 cm), low-grade/G1, Ta-Tumor ohne CIS High-Risk Tumor T1, high-grade/G3-Tumor, multifokal oder rezidivierend ± CIS Intermediate-Risk Alle anderen Tumoren (Ta-1, G1-2, multifokal > 3 cm)

Cytologie 42,9% 100% 81,4% Negativ prädiktiver Wert (npW) Positiv prädiktiver Wert (ppW) Spezifität Sensitivität

Ergebnisse 1 2 Referenzgene getestet: TBP besser als HPRT Urinproben: negative Korrelation zw. Referenzgen- Expression & Erythrozyten / Leukozyten  viele Proben mit Ref.gen unter Nachweisgrenze von 10 Transkriptmolekülen Gewebeproben: weniger Proben mit neg. Referenzgen aufgrund technischer Probleme viele der ersten Proben verworfen oder cDNA nicht mehr ausreichend für vollständige Messung aller Gene

Statistik Gewebe gepaart (n=41) Ki67 XIAP SVV hTERT CK20 UCA1 Tumor (Tu) Median 3,60 17,74 1,77 ,10 14,09 11,77 Min ,00 2,63 ,05 Max 41,29 526,50 22,25 3,89 261,36 209,44 Tumorfrei (Tf) 2,84 17,00 ,93 17,50 1,38 5,45 ,16 37,74 214,27 11,55 3,56 125,63 p (Wilcoxon) ,799 ,518 ,557 ,203 ,181 ,009 Signifikanz: p<0,05

Ki67/TBP in ungepaarten Gewebeproben

XIAP/TBP in gepaarten Gewebeproben

SVV/TBP in gepaarten Gewebeproben

hTERT/TBP in gepaarten Gewebeproben

CK20/TBP in gepaarten Gewebeproben

UCA1/TBP in gepaarten Gewebeproben

Ki67/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen Gesunde: fehlende Werte Null gesetzt

XIAP/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen

SVV/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen

CK20/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen

UCA1/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen

Ki67/TBP in Urinen BCa-Patienten vs. Kontrollen

XIAP/TBP in Urinen BCa-Patienten vs. Kontrollen

SVV/TBP in Urinen BCa-Patienten vs. Kontrollen

CK20/TBP in Urinen BCa-Patienten vs. Kontrollen

UCA1/TBP in Urinen BCa-Patienten vs. Kontrollen

Statistik BCa vs. Controls Ki67 XIAP SVV CK20 P (Wilcoxon) 4,45E-009 2,83E-005 1,43E-012 4,58E-008 Signifikanz: P<0,05

Ki67/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

XIAP/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

SVV/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

CK20/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

UCA1/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

Ki67/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

XIAP/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

SVV/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

CK20/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

UCA1/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

Ki67/TBP im Urin vs.risk group

XIAP/TBP im Urin vs.risk group

SVV/TBP im Urin vs.risk group

CK20/TBP im Urin vs.risk group

UCA1/TBP im Urin vs.risk group

Schlussfolgerungen Eignung als Tumormarker: CK20, Ki67 (UCA1 CAVE: Fallzahl) . Vgl Bca-Kontollen alle Gene hochsignifikant Abhängigkeit vom Tumorstadium Abhängigkeit vom Tumorgrad Einteilung in risk groups sinnvoll XIAP ungeeignet: Expression im Prostata- gewebe => bei BPH Expression in Leukozyten => bei Cystitis

Ausblick Kontinuierliches Follow-up (Zusammenhang Markererhöhung-Rezidivhäufigkeit?) Kombination der Tumormarker (Modell?  Prostata- Krebs-Studie) Vergleich mit Urinzytologie (Cutt-offs?)  Nachsammlung von Urinzytologie läuft bereits (DANKE!!!) Geschlechtsspezifischer Test ( Probleme durch Einfluss von BPH )