Molekulare Zellbiologie Replikation der DNA 15.11.2018 Sebők Ágnes

Das Kornberg-System Matrize-DNA DNA-Polymerase 4 dNTP (ein radiaoaktiv markiert) Puffer-Lösung (kein Primer !) 15.11.2018 Sebők Ágnes

Das Kornberg-Experiment ·       Synthese ·   TCA-Precipitierung ·   Filter-Bindung ·    Waschen (TCA) ·     Messung der Radioaktivitat: Flüssigkeitszintillations-Zahler 15.11.2018 Sebők Ágnes

Das Kornberg-Experiment 1.  DNA ist in vitro synthetisiert (Die Filter ist radioaktiv) 2.  DNA –Synthese ist Matrize-abhängig (A+T/G+C - Ratio der Matrize- und neu-synthetisierte-DNA identisch) 3. Reparatursynthese (Quantität der DNA ist reduziert; kein Primer – Einzelstrangbruche, 5’ -> 3’ Exonuclease-Aktivitat) 15.11.2018 Sebők Ágnes

Das Meselson-Stahl Experiment 14N-DNA – leicht, 15N-DNA – schwer Die Zellen wachsen zuerst im 15N dann im 14N-Medium Proben aus der Kultur nach jeder DNA-Replikation Gleichgewichtsdichtegradient-zentrifugation Zentrifugation der denaturierten DNA 15.11.2018 Sebők Ágnes

Bidirektionale Replikation Replikationsursprung (Origin) Faserautoradiographie 3H-Markierung (heiß danach warm) DNA-Isolation Lichtmikroskopische Autoradiographie 15.11.2018 Sebők Ágnes

Semikonservativ Replikation in eukaryontischen Zellen H3-Thymidin Markierung wahrend der S-Phase und Entfernung des Isotops (Pulse-Chase) Proben nach jeder Replikation Autoradiographie der Chromosomen 15.11.2018 Sebők Ágnes

5’ –>3’ Richtung der DNA-Synthese PCR: 5’-3’ – 3’-5’ Primers: Amplifizierung, 2n 3’-5’ – 5’-3’ Primers: Duplizierung, 2n 15.11.2018 Sebők Ágnes

DNA-Synthese ist Primer-abhangig PCR: Keine Synthese ohne Primers Synthese der DNA-Strecke zwischen der Primers 15.11.2018 Sebők Ágnes

DNA-Synthese ist bidirektional Replikationsursprung (Origin) Faserautoradiographie: 3H-Markierung (heiss danach warm) DNA-Isolation Lichtmikroskopische Autoradiographie warm - heiss– zero –heiss – warm 15.11.2018 Sebők Ágnes

Faserautoradiographie Bidirektionale Synthese: warm– heiß – zero – heiß – warm Hypothetische unidirektionale Synthese: 15.11.2018 Sebők Ágnes

DNA-Replikation ist semidiskontinuirlich Leitestrang, Folgestrang DNA-Ligase Okazaki-Experiment: 3H-Thymidin-markierung von Bakterien Isolation der DNA Separation der DNA nach Strang-Lange: Kleinere Strange (Okazaki-Fragmente) werden miteinander gebunden 15.11.2018 Sebők Ágnes

Eigenschaften der DNA-Replikation (Zusammenfassung) 1. Matrize-abhangig Kornberg-E. 2. dNTP Kornberg-E. 3. Semikonservativ Meselson-Stahl-E. 4. Primer-abhangig PCR 5. 5’->3’ PCR 6. Bidirektional Faserautorad. 7. Semidiscontinuerlich Okazaki-E. 15.11.2018 Sebők Ágnes