Methoden 1. 19.09.2018 Sebők Ágnes

Molekulare Zellbiologie Molekularbiologische Methode I. DNA 19.09.2018 Sebők Ágnes

DNA-Struktur Primärstruktur: Sequenz der Nucleotiden, lineare Polymer, Phosphodiestherbindungen Sekundärstruktur: Doppelhelix, H-Brücken Tertiärstruktur: Superhelix Quarternärstruktur: DNP, Chromatin 19.09.2018 Sebők Ágnes

Sekundärstruktur DNA Die Faltung der Makromolekül Nichtkovalente Bindungen DNA Doppelhelix stabilisiert durch H-Brücken 19.09.2018 Sebők Ágnes

In vivo: In vitro: Hybridiesierung Enzymatisch Wärme (PCR) (DNA-Replikation, Transcription) In vitro: Wärme (PCR) alkalische Lösungen (Southern-blot) Formamid und Harnstoff (Sequenzierung) 19.09.2018 Sebők Ágnes

Sekundär- (Tertiär, Quaternär-) struktur nichtkovalente-Verbindungen Denaturierung: Sekundär- (Tertiär, Quaternär-) struktur nichtkovalente-Verbindungen Hydrolyse: Primärstruktur kovalente Verbindungen 19.09.2018 Sebők Ágnes

UV-Absorption der DNA Absorptionsmaximum : 260 nm Konzentrationsbestimmung Bei Denaturierung steigt der UV-Absorption 19.09.2018 Sebők Ágnes

Schmelztemperatur -Tm diejenige Temperatur, bei der sich 50% der DNA-Stränge trennen steigt mit zunehmenden G/C-Gehalt der DNA (3 H-Brücken) 19.09.2018 Sebők Ágnes

Molekularbiologische Methoden Restriktionsendonucleasen Cloning Molecular hybridisation Southern blot Sequencing PCR Genom library 19.09.2018 Sebők Ágnes

Filter-Hybridisierung Denaturierung Filterbindung Hybridiesierung mit der Probe (radioaktive) Waschen Radiokativität messen Fragen: Anwesenheit der komplementäre Strang Quantität der komplementären DNA/RNA 19.09.2018 Sebők Ágnes

In situ Hybridisierung Mikroskopisches Preparat Denaturierung Hybridiesierung mit der Probe (fluorescent) Waschen Fluorescent Mikroskop (Lichtmikroskop) Fragen: Anwesenheit des komplementären Stranges Wo? 19.09.2018 Sebők Ágnes

Die Restriktionsendonuclease Nuclease – schneidet Phosphodiesterbindungen in Nucleinsäure Endo/Exo – Nuclease Restriktion – Erkennungstellen bzw. Bakterielle Restriktion-Modifikations-System 19.09.2018 Sebők Ágnes

Die Restriktionsendonuclease dsDNA-specifische Endonuclease, mit einer specifischen Erkennungssequenz Palindrom adhäsive oder glatte Ende 19.09.2018 Sebők Ágnes

Restriktionskarten Verdau mit RE Agarose Gelelectrophorese Wanderung zur positiven Electrode Größere Fragmente wandern langsamer Fluoreszierende Farbstoff die an DNA bindet Relative Lagerung der RE-Erkennungsequenzen kann determiniert werden. 19.09.2018 Sebők Ágnes

Separierung der freien Nucleotiden von DNA-Strangen In Vitro DNA-Synthese DNA-Polymerase DNA-Matrize Primer 4 dNTPS , ein radioaktiv markiert Puffer ****** Separierung der freien Nucleotiden von DNA-Strangen 19.09.2018 Sebők Ágnes

Enzymatische DNA-Sequenzierung In vitro DNA-Synthese Primer (oder dNTP) radioaktiv markiert ddNTP (die 3’-OH-Gruppe fählt) 4 in vitro Reaktionen mit 4 verschiedenen ddNTPs (1:10) Denaturierende Electrophorese (PAGE mit Harnstoff und Formamide) Autoradiographie 19.09.2018 Sebők Ágnes

Polymerasekettenreaktion (PCR) In vitro DNA-Synthese Hitzestabile DNA-Polymerase Primer-Paar Zyklen: 1. Denaturierung (95 C) 2. Primer-Bindung (60 C) 3. Primer-Verlängerung (60-70 C) Gelelectrophorese 19.09.2018 Sebők Ágnes

PCR Existenz einer Sequenz in der DNA-Mischung Klonierung (Amplifizierung) Länge der DNA-Fragment -Mutationsanalyse 19.09.2018 Sebők Ágnes

Molekulare Zellbiologie Molekularbiologische Methode - Genexpression 19.09.2018 Sebők Ágnes

Polymerasekettenreaktion (PCR) In vitro DNA-Synthese Hitzestabile DNA-Polymerase Primer-Paar Zyklen: 1. Denaturierung (95 C) 2. Primer-Bindung (60 C) 3. Primer-Verlängerung – DNA synthese (60-70 C) (Gelelectrophoresis) 19.09.2018 Sebők Ágnes

PCR - Anwendung (Fragen) Existenz einer Sequenz (Infections, Krebs) Klonierung (Amplifizierung) Mutationsanalyse (Länge der DNA-Fragment) Quantität einer Sequenz – Real-time PCR 19.09.2018 Sebők Ágnes

Real-time PCR In vitro DNA-Synthese Primer-Paar Hitzestabile DNA-Polymerase Primer-Paar Dritte Primer : mit fluroreszent Farbsott und Auslöscher Polimerase macht fluoreszent Farbstoff frei – gleichzeitige (real-time) Quantifikation 19.09.2018 Sebők Ágnes

Genexpression DNA mRNA Protein Phenotyp Transcription Translation Protein-Function Phenotyp 19.09.2018 Sebők Ágnes

Gentechnik in vivo Expression von fremden Genen Hinderung der endogenen Gen-Expression 19.09.2018 Sebők Ágnes

Gentechnik in vivo 1. Expression von fremden Genen Gen-Transfer in Zelle Transgene Organisme 19.09.2018 Sebők Ágnes

Hinderung der endogenen Genexpression – I. I. DNA KO-mutation 19.09.2018 Sebők Ágnes

Hinderung der endogenen Genexpression – II. II. RNA Antisense RNA Ribosyme RNA-Interferenz 19.09.2018 Sebők Ágnes

Hinderung der endogenen Genexpression – III. III. Proteine Microinjection von Antikörper Intrazellulläre Antikörper Expression von dominanten hemmenden Proteinen Peptidomimetiken 19.09.2018 Sebők Ágnes

mRNA 19.09.2018 Sebők Ágnes

Molekulare Zellbiologie Transcription und Processing der mRNA 19.09.2018 Sebők Ágnes

Transcription der mRNA RNA Polymerase II. Nucleoplasma Primärtranscript: pre-mRNA = hnRNA (heterogen nuclear RNA) Untereinheiten: Histon-acetyltransferase Helicase Posttranscriptionale Modifizierungen 19.09.2018 Sebők Ágnes

Initiation der mRNA-Synthese Promoter: Core P: TATA-box Enhancer Transcriptionsfaktoren allgemeine regulatorische 19.09.2018 Sebők Ágnes

RNA-Capping 5‘-Ende Enzyme: 5‘-5‘ Verknüpfung, Triphosphat-Brücke Nucleotide Phosphohydrolase Guanyltransferase Methyltransferase 5‘-5‘ Verknüpfung, Triphosphat-Brücke Function: Stabilität der mRNA (histon mRNA-s ohne poly-A) Export aus dem Zellkern Ribosome-Bindung (Proteinsynthese) 19.09.2018 Sebők Ágnes

Polyadenierung 3‘-Ende Poly-A Signalsequenz Endonuclease Poly-A-Polymerase Poly(A) Schwanz: 200-300 Ns. Function: Stabilität der mRNA Export aus dem Zellkern 19.09.2018 Sebők Ágnes

Struktur der pre-mRNA und mRNA Intron – Exon 5‘ und 3‘-nichtkodierender Bereich Cap und poly-A-Schwanz 19.09.2018 Sebők Ágnes

RNA-Spleißen Introns Entfernen und Exons miteinander verbinden 5‘ und 3‘ Spleiße-Signalsequenzen snRNP: Rybosym 19.09.2018 Sebők Ágnes

RNA-Spleißmechanismus 5‘ - U1 ; 3‘ – U2 U4/U6 und U5 Schnitt an der 5‘-Spleisstelle Lariatbildung (Schlaufe) Schnitt an der 3‘-Spleisstelle Verbindung der Exonsequenzen 19.09.2018 Sebők Ágnes

Spleißung-Krakheiten SLE (systemische Lupus erythematodes) Autoimmunerkrankung Anti-snRNP-Antikörper Thalassemia Anaemia: a- und b-Globin-Synthese ist ruduziert Mutation der Spleisstelle 19.09.2018 Sebők Ágnes

Replikation 1. 19.09.2018 Sebők Ágnes

Molekulare Zellbiologie Replikation der DNA 19.09.2018 Sebők Ágnes

Das Kornberg-System Matrize-DNA DNA-Polymerase 4 dNTP (ein radiaoaktiv markiert) Puffer-Lösung (kein Primer !) 19.09.2018 Sebők Ágnes

Das Kornberg-Experiment ·       Synthese ·   TCA-Precipitierung ·   Filter-Bindung ·    Waschen (TCA) ·     Messung der Radioaktivitat: Flüssigkeitszintillations-Zahler 19.09.2018 Sebők Ágnes

Das Kornberg-Experiment 1.  DNA ist in vitro synthetisiert (Die Filter ist radioaktiv) 2.  DNA –Synthese ist Matrize-abhängig (A+T/G+C - Ratio der Matrize- und neu-synthetisierte-DNA identisch) 3. Reparatursynthese (Quantität der DNA ist reduziert; kein Primer – Einzelstrangbruche, 5’ -> 3’ Exonuclease-Aktivitat) 19.09.2018 Sebők Ágnes

Das Meselson-Stahl Experiment 14N-DNA – leicht, 15N-DNA – schwer Die Zellen wachsen zuerst im 15N dann im 14N-Medium Proben aus der Kultur nach jeder DNA-Replikation Gleichgewichtsdichtegradient-zentrifugation Zentrifugation der denaturierten DNA 19.09.2018 Sebők Ágnes

Bidirektionale Replikation Replikationsursprung (Origin) Faserautoradiographie 3H-Markierung (heiß danach warm) DNA-Isolation Lichtmikroskopische Autoradiographie 19.09.2018 Sebők Ágnes

Semikonservativ Replikation in eukaryontischen Zellen H3-Thymidin Markierung wahrend der S-Phase und Entfernung des Isotops (Pulse-Chase) Proben nach jeder Replikation Autoradiographie der Chromosomen 19.09.2018 Sebők Ágnes

5’ –>3’ Richtung der DNA-Synthese PCR: 5’-3’ – 3’-5’ Primers: Amplifizierung, 2n 3’-5’ – 5’-3’ Primers: Duplizierung, 2n 19.09.2018 Sebők Ágnes

DNA-Synthese ist Primer-abhangig PCR: Keine Synthese ohne Primers Synthese der DNA-Strecke zwischen der Primers 19.09.2018 Sebők Ágnes

DNA-Synthese ist bidirektional Replikationsursprung (Origin) Faserautoradiographie: 3H-Markierung (heiss danach warm) DNA-Isolation Lichtmikroskopische Autoradiographie warm - heiss– zero –heiss – warm 19.09.2018 Sebők Ágnes

Faserautoradiographie Bidirektionale Synthese: warm– heiß – zero – heiß – warm Hypothetische unidirektionale Synthese: 19.09.2018 Sebők Ágnes

DNA-Replikation ist semidiskontinuirlich Leitestrang, Folgestrang DNA-Ligase Okazaki-Experiment: 3H-Thymidin-markierung von Bakterien Isolation der DNA Separation der DNA nach Strang-Lange: Kleinere Strange (Okazaki-Fragmente) werden miteinander gebunden 19.09.2018 Sebők Ágnes

Eigenschaften der DNA-Replikation (Zusammenfassung) 1. Matrize-abhangig Kornberg-E. 2. dNTP Kornberg-E. 3. Semikonservativ Meselson-Stahl-E. 4. Primer-abhangig PCR 5. 5’->3’ PCR 6. Bidirektional Faserautorad. 7. Semidiscontinuerlich Okazaki-E. 19.09.2018 Sebők Ágnes