mRNA (post-transkriptionale Modifizierung)

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1 mRNA (post-transkriptionale Modifizierung)
Die Messenger RNA (mRNA) erhält nach der Transkription sowohl eine 5‘-Kappe wie einen 3‘-Polyadenylat-Schwanz (post-transkriptionale Modifizierung) 5‘-Kappe 3‘-Poly(A)-Schwanz mRNA

2 3‘ Polyadenylat-Schwanz
der Polyadenylatschwanz wird erst zum Ende der Transkription von einem Enzym (PolyA-Polymerase) an das gespaltende 3‘-Ende angehängt (Transkriptions-Termination) 3‘ n = Nukleotide Spaltung durch Endonuclease Der polyA-Schwanz 1. erhöht Stabilität der mRNA 2. wichtig beim Export der mRNA ins Zytoplasma Spaltsignal 3‘ UTR ORF mRNA mRNA 5‘ 5‘ 5‘ 5‘

3 Die Polyadenylierung der mRNA
DNA polyA-Polymerase mRNA RNA-Polymerase

4 Der Poly(A)-Schwanz erlaubt die einfache und schnelle biochemische Reinigung von poly(A)+ RNA durch Affinitätschromatographie Säule mit poly(U) gebunden an kleine Sepharose-Kügelchen reine poly(A)+ RNA >Northern, cDNA-Synthese, RT-PCR

5 Die Bildung der 5‘-Kappe an der mRNA erfolgt nur bei Eukaryonten
der 5‘-Kappe wird noch während der Transkription von den entsprechenden Enzymen (“capping enzymes“) an das 5‘-Ende angehängt die 5‘-Kappe erhöht die Stabilität der mRNA - Kontrolle der Gen- Expression die 5‘-Kappe ist wichtig beim Export der mRNA in das Zytoplasma und bei der anschließenden Translation (Anlocken von Initiationsfaktoren der Translation) 7 5‘ ungewöhnliches 5‘-5‘Triphosphat vom Gen kodiert später angehängt 5‘ 2‘ 3‘

6 RNA-Turnover

7 De-Adenylierung und Entfernung der 5‘-Kappe sind Signale zum Abbau der mRNA
“decapping enzyme“

8 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

9 das Spleißen der Prä-mRNA
……eine weitere post-transkriptionale Veränderung das Spleißen der Prä-mRNA

10 Die Entdeckung des Spleiß-Phänomens
bis 1977 hatte man die Vorstellung, daß die DNA-Sequenz eines Gens co-linear mit der Aminosäure-Sequenz ist als man aber die reife mRNA von bestimmten Genen isolierte (polyU-Affinitätschromato- graphie) und mit der entsprechenden DNA-Matritze hybridisierte und die DNA::RNA- Hybride im Elektronenmikroskop sichtbar machte, gab es eine unerwartete Entdeckung >>>> die gereinigte mRNA war viel kürzer als die DNA-Matritze TACGGATCGTA ACAGTAGGCTATAAC AUGCCUAGCAU-UGUCAUCCGAUAUUG N C T A NNN N N Intron Exon

11 Die Struktur des Hühner-Ovalbumin-Gens
Elektronenmikroskopie Zeichnung E mRNA DNA-Matritze die Schleifen A-G sind die 7 Introne, die im primären Transkript noch vorhanden sind, später aber bei der Reifung der mRNA herausgeschnitten werden. das Entfernen der Introne wird als Spleißen (“splicing“) bezeichnet

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13 Die Prä-mRNA des Ovalbumins
AUG Stop Exon Intron 8000 Nts Intronsequenzen werden durch Spleißen entfernt reife mRNA Protein (Ovalbumin) Translation Prä-mRNA

14 Nur ein geringer Teil der DNA codiert für Proteine
Chromosom mit 1.5 x 108 Nucleotid-Basenpaaren - ca Gene 0.5% des Chromosoms enthält Gene >>> 15 Gene ein Gen mit 105 Nucleotid-Basenpaaren Intron Exon Promoter Transkription Prä-mRNA Spleißen mRNA

15 Die Enstehung von Vorläufer- und reifer mRNA
Transkription Bildung der 5‘-Kappe Exon Intron Spleißosome prä-mRNA Spleißen Polyadenylierung Intron mRNA

16 Splicing - Intron/Exon-Größen
> das Spleißen ist ein äußerst komplizierter Vorgang - ca. 300 Komponenten beteiligt > der Spleiß-Enyzm-Komplex wird Spliceosome genannt > die meisten Gene höherer Eukaryonten haben Introne (bis zu 40 pro Gen) > die Exone sind weniger als 1000 BP lang, in der Regel Nukleotide (entspricht Aminosäuren) > die Größe der Introne schwankt von Nukleotide > die DNA, die den Intronen entspricht, ist daher viel mehr als die DNA, die für die Exone kodiert (Gen > BP; mRNA > BP)

17 die Entfernung des Introns aus der Prä-mRNA muß äußerst präzise ablaufen, damit die reife mRNA korrekt für das entsprechende Protein kodiert die Präzision muß auf ein Nukleotid genau sein (molekulares Skalpell) mRNA Korrekt gespleißt korrektes Spleißen prä-mRNA fehlerhaftes Spleißen > frameshift Mutation >andere Aminosäuresequenz mRNA falsch gespleißt

18 Wie schneidet das Spliceosom derart korrekt die Introne aus der Prä-mRNA?
man findet beim Vergleich der Exon/Intron-Übergänge bzw. Intron/Exon-Übergänge Consensus-Sequenzen A G G U A A G U…………………..C A G G Consensus-Sequenz 5‘-Spleißstelle 3‘-Spleißstelle

19 Allgemeine Regeln bei den Spleiß-Consensus-Bereichen
die Basensequenz eines Introns beginnt GU und endet mit AG Introne haben noch eine wichtige interne Stelle, die stets ca Nukleotide stromaufwärts von der 3‘ AG-Spleißstelle liegt und Verzweigungsstelle (“branch site“) genannt wird. In Hefe lautet die Verzweigungsstelle nahezu immer UACUAAC (TACTAAC-Box) Bereiche zwischen der 5‘ und 3‘ Spleißstelle und der Verzweigungsstelle sind relativ unwichtig für das Spleißen des Introns durch Mutationen in jeder dieser drei wichtigen Regionen kann es zur Hemmung des Spleißens bzw. zu einem veränderten Spleißen kommen falsches Spleißen verursacht auch Krankheiten, z. B. einige Formen von Thalassämien = erbliche Blutkrankheiten (Anämien) >>> defekte Hämoglobinsynthese 5‘-Spleißstelle “branch site“ 3‘-Spleißstelle

20 (2) Mutierte Globin prä-mRNA
(1) Normale Globin prä-mRNA Exon 2 Exon 3 Exon 1 Intron 2 Intron 1 Exon 2 Exon 3 Exon 1 mRNA Protein (2) Mutierte Globin prä-mRNA Exon 2 Intron 2 Punktmutation Exon 1 verlängertes Exon Intron 1 Exon 3 b-Thalassämien Stop Exon 2 Exon 1 mRNA Exon 3 kein Häm 128 Protein -----CCTATTGGTCTATTTTCCACCCTTAG GCTG -----CCTATAG GTCTATTTTCCACCCTTAG GCTG--- Mutation Exon 2 Exon 3 normale Spleißstelle Stop Codon neue Spleißstelle (2) (1)

21 Der Mechanismus des Prä-mRNA Spleißens
am Spleißvorgang sind viele Komponenten beteiligt U-snRNA (Uridin-rich, small nuclear RNA) Spleiß-Enzyme U2 U-snRNAs 5‘-Kappe 3‘ U1 + Proteine U-snRNPs (Snurps) U5 U6 U4

22 Der Biochemie des Spleißvorgangs
biochemisch handelt es sich beim Spleißen um die Spaltung und Neubildung von Phosphodiester-Bindungen = Transesterifizierungs-Reaktionen (ohne Energie) Exon 2 Intron das Spleißen beginnt mit einem nukleophilen Angriff der 2‘-OH-Gruppe des kon- servierten Adenins innerhalb des Introns auf die 3‘-5‘ Phosphodiester-Bindung am 5‘ Exon/Intron-Übergang Exon 2 konserviertes A in TACTAAC-Sequenz es entsteht das Lasso-Intermediat (“lariat“)

23 Der Mechanismus des Prä-mRNA Spleißens
5‘ Verzweigung 3‘ U-snRNPs (Snurps) die verschiedenen U-snRNPs reagieren nacheinander mit den verschiedenen Spleiß- stellen, bis sich ein funktions- fähiges Spliceosom ausgebildet hat U1 und U2 die 5‘-Spleißstelle und die Verzweigungsstelle U1 verläßt das Spliceosom U4, U5 und U6 lagern sich zusammen bei der Bindung von U4, U5 und U6 kommt es zum 5‘-Spleißen U6 hält Exon 1 im Spliceosom (Lasso-Bildung “lariat“) U2 und U4 verlassen das Spliceosom U5 und U6 verlassen das Spliceosom Ex1 Ex2

24 Wie können die Snurps am Spleißvorgang teilnehmen?
5‘ 3‘ U1 die snRNA-Moleküle haben an den Stellen, an denen keine Proteine gebunden sind, einzel- strängige RNA-Bereiche, die komplimentär zu den Consensus-Bereichen im Intron sind U1 bindet an die 5‘-Spleißstelle U2 bindet an die Verzweigungsstelle U5 bindet an die 3‘-Spleißstelle U1 U2 GUCCAUUCA hemmendes Oligonukleotid U1 Exon 1 Exon 2 Intron Verzweigungsstelle 5‘-Spleißstelle 3‘-Spleißstelle

25 Hemmung des Spleißvorgangs durch Auto-Immunantikörper
Hemmung des in vitro Spleißens durch Auto-Immunantikörper (Patienten mit systemischem Lupus erythematodes) Autoimmun-Krankheit: Antikörper gegen zelleigene Proteine; z. B. gegen die Sm-Proteine der U-snRNPs Gelenke und die meisten Organsysteme stark beeinträchtigt >>>> Schlüsselrolle der U-snRNPs beim Spleißen entdeckt mit Hilfe dieser AK

26 Der Mechanismus des Prä-mRNA-Spleißens

27 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

28 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

29 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

30 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung
9 kb = BP/3 = AS x 100 Da = Da

31 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung
52 Ein Gen enthält zwei Exons: Die Anzahl der Basen in der codierenden Sequenz beträgt 300 im Exon 1 und 600 im Exon 2. Die mittlere relative Molekülmasse der von diesen Exons codierten Aminosäuren ist 110/Aminosäure. Welche relative Molekülmasse wird für das codierte Protein mit einem Fehler von plus/minus 1000 bestimmt? (A) 3 000 (B) (C) (D) (E)

32 Warum gibt es Introne in der prä-mRNA, die beim Reifung zur
mRNA entfernt und abgebaut werden? Welche physiologische Bedeutung hat das Spleißen?

33 Alternatives Spleißen
Welche physiologische Bedeutung hat das Spleißen? warum Gene Introne haben ist in vielen Fällen noch unklar (Introne sind letztendlich Abfall!) Man kennt physiologisch-relevante Spleißvarianten: (1) alternatives Spleißen: erlaubt, aus einem einzigen Gen mehrere Genprodukte zu erhalten (Dogma 1 Gen > 1 Protein) (2) Trans-Spleißen: 5‘-Exon eines Gens wird an das 3‘-Exon eines anderen Gens gehängt >> dies ermöglicht der Zelle neue Genprodukte (Proteine) mit neuer Funktion zu schaffen Alternatives Spleißen (z. B. 3‘-alternativ) Intron Alt.Exon Exon 1 Exon 2 Alt.Exon Alt.Exon Intron 3‘ Exon 1 Exon 2 Alt.Exon Intron 5‘ 3‘ Exon 1 Exon 2 Beispiele für alternatives Spleißen findet man bei den Immunglobulinen, Myosine, Hormonen etc.

34 Der Lebenszyklus einer mRNA