Molekular-genetische Früherkennung von Stress und Stresstoleranz im Keimlingswurzelsystem von Getreiden Frank Hochholdinger Zentrum für Molekularbiologie der Pflanzen Universität Tübingen Ab 1.9.2010 Universität Bonn INRES Crop Functional Genomics

Molekular-genetische Analyse der Wurzelentwicklung von Mais Arbeitsgebiet: Molekular-genetische Analyse der Wurzelentwicklung von Mais Mutanten der Wurzelarchitektur Wildtyp rtcs rum1 lrt1 rth3 Kron-wurzeln Kron-wurzeln Seminal-wurzeln Seminal-wurzeln Seminal-wurzeln Lateral wurzeln Lateral wurzeln Lateral wurzeln Primärwurzel (Wurzelhaare) Wurzelhaare

Laser capture microdissection Arbeitsgebiet: Strategien Phänotypen Zellen Gewebe Mutanten Laser capture microdissection Gene Map based cloning Transcriptomics/ Proteomics Split YFP EMSA Y2H Interaktionen Funktion

Arbeitsgebiet: Methoden (Auswahl) Maisgenetik + Klonierung von Maisgenen Isolierung spezifischer Zelltypen aus dem Gewebeverband (Laser Capture Microdissection) Proteomics: 2-DE und Shotgun Transcriptomics: Microarray und RNAseq Interaktionsstudien: Split YFP, Y2H, EMSA, ChIP

Ziele erste Antragsphase: Fragestellung & Pflanzenmaterial Wie wirkt sich sehr früher Trockenstress auf die weitere Wurzelentwicklung aus? Phänotyp und molekulare Änderungen Seminalwurzeln Trockenstress Primärwurzel 3 d Modellorganismus: Mais (Zea mays L.) Pflanzenmaterial: Inzuchtlinien vs. Hybride Mutanten vs. Wildtyp GFP (RFP, YFP) Markerlinien

Ziele erste Antragsphase: Versuchsaufbau Trockenstress Transfer in Erde (Feld/Gewächshaus) Keimung in Papier

GFP-Linien können von Dave Jackson (CSHL) bezogen werden Ziele erste Antragsphase: Phänotyp: Visualisierung der Wurzelentwicklung Stressinduzierbare Markerlinie Stressausbreitung GFP-Linien können von Dave Jackson (CSHL) bezogen werden Änderung der Wurzel- Architektur nach Stress Inzuchtlinien vs. Hybride Mutanten vs. Wildtyp GFP Markerlinien

Ziele erste Antragsphase: Phänotyp: Visualisierung der Wurzelentwicklung Hypothesen: Stress beeinflusst die weitere Entwicklung bereits initiierter Wurzeln (Primär- und Seminalwurzeln) Stress beeinflusst die Entwicklung noch nicht gebildeter Wurzeln schwächer (Lateral- u. sprossbürtige Wurzeln) Später gebildete Wurzeltypen können Defekte der frühen Wurzelentwicklung kompensieren Verschiedene Wurzeltypen reagieren unterschiedlich auf Stress Wurzelsysteme von Hybriden sind weniger stressanfällig als ihre elterlichen Inzuchtlinien Stressanfälligkeit ist genotypabhängig Gesamtentwicklung der gestressten Pflanze und Ertrag sind durch frühen Stress betroffen. Inzuchtlinien vs. Hybride Mutanten vs. Wildtyp GFP Markerlinien

Reads on all SNPs in gene A Ziele erste Antragsphase: Molekularbiologie: Änderung der Genexpressionsmuster in Wurzeln nach Stress (RNA-Ebene) in Inzuchtlinien und Hybriden Methode: RNAseq (Illumina sequencing) Sequenzierung: ~1.4 Gigabasen/Probe (>30 Mio Sequenzen à 42 bp) Birchler et al., 2003 Gene A Kartierung (inkl. SNPs) B73 Hybride Mo17 Gesamtexpression: Sequenzen pro Gen Allelspezifische Expression in Hybriden (SNPs) Reads on all SNPs in gene A Reads/ gene A BxM MxB B73 B73xMo17 Mo17 Mo17xB73 B73 Mo17

Ziele erste Antragsphase: Molekularbiologie: Änderung der Genexpressionsmuster in Wurzeln nach Stress (Proteinebene) in Inzuchtlinien und Hybriden Methode: Proteomics quantitative shotgun Sequenzierung SDS-PAGE nanoLC-MS/MS ~ 3000 Proteine (≥ 2 Peptide) In silico Rekonstruktion Shotgun Sequenzierung Funktionelle Annotation

Ziele erste Antragsphase: Molekularbiologie: Änderung der Genexpressionsmuster in Wurzeln nach Stress Hypothesen: Stress induziert/reprimiert unterschiedliche Gene in Seminal- und Primärwurzeln Stress induziert Gene, die vorher nicht aktiv waren (Presence Absence Variation: PAV) PAV ist wurzeltyp- und genotypspezifisch Hybride reagieren in Bezug auf die Genexpression anders auf Stress als Inzuchtlinien Es gibt Gene, die reagieren unabhängig von Genotyp und Wurzeltyp auf Stress In Hybriden beeinflusst Stress allelspezifische Genexpressionsmuster im Vergleich zu Kontrollexperimenten Stress regulierte Gene fallen in bestimmte funktionelle Klassen Die Aktivität von Genen und die Akkumulierung der davon abgeleiteten Proteine korreliert wegen der unterschiedlichen Regulationsmechanismen nur partiell miteinander

Langfristige Ziele: Ausweitung der Analyse auf größere Zahl von in der Züchtung verwendete Genotypen Korrelation von differentiell exprimierten Genen mit Grad der phänotypischen Stressreaktion in diesen Genotypen Genetische Charakterisierung von Kandidatengenen deren Expression mit der phänotypischen Stressreaktion korreliert (Herstellung von Mutanten und deren Analyse) Assoziation von Sequenzpolymorphismen mit phänotypischer Stressreaktion in jungen Keimlingswurzeln (genomweit oder mit Kandidatengenen) Vorhersage der Stresstoleranz bestimmter Genotypen aufgrund der Expression und/oder genomischer Polymorphismen eines überschaubaren Satzes diagnostischer Gene