Formatvorlage des Untertitelmasters durch Klicken bearbeiten In vitro Characterization of unknown Isoforms of Erythropoietin and Evaluation of their Biological Importance Institut für Molekulare Psychiatrie und Institut für Experimentelle Neurologie Christel Bonnas PhD of Medical Neurosciences

Erythropoietin – ein Therapeutikum mit langer Geschichte 1893: Bildung von Erythrozyten als Ergebnis einer verminderten Sauerstoffversorgung (Friedrich Miescher) 1906: humoraler Faktor regelt die Blutbildung (Paul Carnot) 1948: Erythropoietin (Eva Bonsdorff, Eeva Jalavisto) 1977: Isolierung von humanem EPO aus Urin (Eugene Goldwasser) 1983: Isolierung des humanen EPO Gens (Amgen) 1985:Expression von rhEPO in Säugetierzellen 1989: Zulassung von EPOGEN (Amgen) zur Therapie von Anämien 2001:Gentechnisch verändertes Erythropoetin, Darbepoetin α (Amgen) heute: gehört zu den 10 weltweit erfolgreichsten Therapeutika (EPO-Präparate der ersten und nächsten Generation, Biosimilars)

Erythropoietin – mehr als ein hämatopoietischer Faktor?  Entdeckung von EPO-Expression im Gehirn (Chikuma et al., 2000)  Nachweis neuro- und zytoprotektiver Effekte in zahlreichen in vitro und in vivo Krankheitsmodellen - Schlaganfall (Brines et al., 2000) - Herzinfarkt (Calvillo et al., 2003)  Behandlung von Schizophrenie-Patienten mit rhEPO verbessert kognitive Fähigkeiten in einer Phase II-Studie (Ehrenreich et al., 2007) und verzögert den Verlust von grauer Substanz (Ehrenreich et al., 2010)  Wirksamkeitsstudie von EPO in Schlaganfallpatienten scheitert; erhöhte Mortalität in der EPO Gruppe bei thrombolysierten Patienten (Ehrenreich et al., 2009)  Entwicklung nicht-hämatopoietischer EPO-Derivate (AsialoEPO, Erbayraktar et al. 2003; Carbamylated EPO, Leist et al. 2004)

Entdeckung endogener EPO-Spleißvarianten im Gehirn und in der Niere der Maus und des Menschen mEPOmS Mausgehirn 650 bp 500 bp PCR Klon EPO PCR 650 bp 500 bp EPO-PCR humane Niere EPO wt (Maus: 579 bp, Human: 582 bp) gu ag Exon Exon ‘ 5 hS3 (495 bp) hS4 (486 bp) ag Exon mS (399 bp) I. Isolierung der Spleißvarianten aus PCR-Produkten II. Kodierende Sequenz der humanen (hS3 und hS4 ) und murinen (mS) Varianten mS hS3 III. Strukturvorhersage der Spleißvarianten mS und hS3 EPO hEPO hS3 hS4 „4-Helix“„2-Helix“„3-Helix“

Die EPO-Spleißvarianten zeigen keine hämatopoietischen Effekte in vitro und in vivo CFU-E * + EPO * Zahl CFU-E pro Zellen * I. Agar-Kolonie-Test (in vitro) Aussaat murinen Knochenmarks +/- EPO- Varianten i.p. Injektion von EPO und hS3 (42 µg/kg): Tag 0Tag 2Tag 5Tag7 Hämatokrit * Hä m at ok rit( %) * rhEPO Co II. Hämatokrit-Test (in vivo)

Die Spleißvarianten vermitteln vergleichbare neuroprotektive Effekte wie EPO in einem in vitro Modell der zerebralen Ischämie 8 DIV: EPO / vEPO Behandlung 10 DIV: OGD (Sauerstoff- und Glucose-Entzug) 11 DIV: LDH Messung Pyruvat + NADH + H+  Laktat + NAD+ Schutz (%) Neuronenkultur

EPO und die Spleißvarianten unterscheiden sich in ihrer Wirkung auf Stammzellen cohEPOhS3  Die humane Spleißvariante hS3 aber nicht EPO fördert die Proliferation von mesenchymalen Stammzellen. Kolonie-Test MSC α-Olig α-GFAPα-DCX Murine Mesenchymale Stammzellen Murine Neuronale Stammzellen  Die humane Spleißvariante hS3 schützt neuronale Stammzellen.  In Gegenwart von hS3 vermehrte Differenzierung von neuronalen Progenitorzellen zum astroglialen Typ

Die LIF-Rezeptor Familie als mögliche Bindungsstelle für die humane Spleißvariante hS3 EPO-EPOR-Komplex  nur eine Kontaktstelle zum EPOR- Dimers  keine Verdrängung von radioaktivem EPO Die humane Spleißvariante hS3 bindet nicht an den EPO-Rezeptor Indizien weisen auf die LIFR- Familie als Bindungsstelle  biologische Wirkung  neuroprotektive Eigenschaft von hS3 wird durch den löslichen LIFR und durch Antikörper gegen den Rezeptor aufgehoben

Anwendbarkeit der EPO-Spleißvarianten Im Gegensatz zu EPO sind die Spleißvarianten rein zytoprotektive und regenerative Moleküle  Mögliche Anwendbarkeit zur Therapie von chronischen neurodegenerativen und psychiatrischen Erkrankungen wie Multiple Sklerose, Morbus Parkinson oder Schizophrenie  Mögliche Anwendbarkeit im Bereich der regenerativen Medizin

 MEISEL, A., PRILLER, J., BONNAS, C., & DIRNAGL, U. (2006). Erythropoietin variants (C07/K 14/435 ed.).  PRILLER, J., BONNAS, C., & MEISEL, A. (2007). Method of cell culture and method of treatment comprising a vEPO protein variant (C07K 14/505 ( ), A61K 38/18 ( ) ed.).  MEISEL, A., PRILLER, J., BONNAS, C. (2009). Uses and methods for the identification of a cytoprotective compound involving gp130 or LIFRα. PCT/EP2010/ Patente

Danksagung Molekulare Psychiatrie und Experimentelle Neurologie Prof. Dr. Josef Priller Prof. Dr. Andreas Meisel Dr. Thomas Götz Dr. Stefanie Maerschenz Claudia Muselmann Carena Teufelhardt Christian Böttcher Dr. Peter Saiger Dr. Sylvia Vogel