Der EPO-Rezeptor und seine Funktionen

Präsentation zum Thema: "Der EPO-Rezeptor und seine Funktionen"—  Präsentation transkript:

1 Der EPO-Rezeptor und seine Funktionen

2 Das ‘Janus-Gesicht’ der Tumorhypoxie
Adaptive Prozesse Aggressiver Phänotyp Tumorprogression Erworbene Therapieresistenz Verringerte Proliferation Differenzierung Apoptose Nekrose Hypoxia results from an imbalance between the supply and consumption of oxygen. Locally advanced or large tumors cannot adequately counteract the restriction in oxygen supply and thus the development of hypoxia. Tumor hypoxia can have contradictory effects. Tumor hypoxia is a therapeutic problem, since it can make tumors resistant to radio- and chemotherapy and lead to tumor progression. Schlüsselbotschaft Die überwiegende Mehrzahl hypoxischer Tumorzellen leiden unter diesen Folgen. Ein kleiner Teil (< 5%?) der Zellen zeigt jedoch ein ganz anderes Verhalten, sie bestimmen das Schicksal des Krebspatienten.

3 Negative Beeinflussung des langfristigen Ergebnisses
Eine Hypoxie führt zur Selektion eines Phänotyps aggressiver Tumorzellen Schlechte Durchblutung Anämie Hypoxie Resistenz gegen Chemotherapie und Bestrahlung Selektionsdruck  Genominstabilität  Adaptationsvorgänge  Anemia is one of several factors that influence tumor oxygenation. Tumor hypoxia can lead to tumor progression, which can lead to adverse outcomes for cancer patients Maligne Progression Negative Beeinflussung des langfristigen Ergebnisses

4 Teufelskreis von Tumorhypoxie und maligner Progression
Tumorhypoxie (feindliche Mikroumgebung) Tumorhypoxie/Anämie: verstärkt die Aggressivität des Tumors verstärkt die Therapie- resistenz verkürzt die Überlebenszeit vermindert die lokale Kontrolle Veränderungen der Genexpression Proteomveränderungen (< 1% O2) Tumor- förderung Genomveränderungen (< 0,1% O2) Klonselektion Tumor hypoxia is part of a negative-feedback cycle that leads to Increased tumor aggressiveness Increased resistance to therapy Decreased survival Decreased local control Maligne Progression  Aggressivität Vaupel et al. In: Nowrousian MR, ed. Recombinant Human Erythropoietin (rhEPO) in Clinical Oncology. Berlin, Springer, 2002:127–46.

5 Oxygenierungsstatus als Funktion der Hämoglobinspiegel (cHb)
Karzinome im HNO-Bereich n=142 Durchschnitt +/- SEM Karzinome der Zervix uteri n=104 Durchschnitt +/- SEM Medianer pO2 (mmHg) Medianer pO2 (mmHg) cHb (g/dl) cHb (g/dl) Hb levels can affect tumor oxygenation status High Hb levels (< 14g/dL) are associated with worsening tumor oxygenation. There is an optimal oxygenation status within a gender-specific Hb range. Hb levels need to be strictly regulated within this optimum range in anemic patients. Es gibt einen optimalen Oxygenierungsstatus innerhalb eines geschlechtsspezifischen cHb-Bereichs Becker et al. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2000;46:459–66. Vaupel et al. Strahlenther Onkol 2001.

6 Oxygenierungsstatus als Funktion des Hämoglobinspiegels
100 80 (5) (3) (5) (8) (3) 60 50 40 Normale Mamma 30 20 Medianer pO2 (mmHg) 10 8 (9) 6 (9) 5 (9) 4 (3) In normal tissues, oxygenation status remains relatively constant over a range of Hb levels from 8–15 g/dL. In contrast, in tumor tissue, oxygenation status is dependent on Hb level. In breast cancers, even mild anemia is a major causative factor for the development of hypoxia. 3 Mammakarzinome 2 (7) 1 8 10 12 14 Hb (g/dl) Vaupel et al. Cancer Res 2003;63:7634–7.

7 Tumoroxygenierung und Überleben
Zervixkarzinom Alle behandelten Patientinnen (n = 89) 1.0 n n 0.8 Medianer pO2 ≥ 10 mmHg (n = 41) 0.6 Gesamt-Überlebenswahrscheinlichkeit 0.4 Medianer pO2 < 10 mmHg (n = 48) Patients with hypoxic tumors have significantly worse survival probabilities than patients with non-hypoxic tumors. 0.2 Log-Rank p = 0,0039 10 20 30 40 50 60 70 80 Zeitraum (Monate) Höckel et al. Cancer Res 1996;56:4509–15.

8 Oxygenierung von normalem Gewebe und Tumoren im HNO-Bereich
Normalgewebe kann eine leichte Anämie kompensieren; Tumoren können dies nicht Tumoren im HNO-Bereich p < 0,0001 Normalgewebe 50 (M. sternocleidom.) Gewebe-pO2 (mm Hg) This study by Becker et al. shows the oxygenation status of normal tissue versus tumor tissue. In patients with head and neck cancer, normal tissue can, to a certain extent, correct for mild anemia, unlike tumor tissue. Tumor Mäßige/starke Leichte Anämie Normaler Anämie (Hb <11 g/dl) Hb F: 11,0–11,9 g/dL M: 11,0–12,9 g/dL Hb-Wert Becker et al. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2000;46:459–66.

9 Maximale Tumoroxygenierung im Hb-Bereich zwischen 12,2 und 14,4 g/dl
Henke (2003) RT –Studie lag über diesem Wert 18 16 14 12 10 Hb (g/dl) 2 4 6 8 Zeit (Wochen) Placebo EPO Henke (2003) HNO Becker (2000), Vaupel (2002) Plattenepithelkarzinom Medianer pO2 (mmHg) 20 It is widely accepted that maximal tumor oxygenation occurs within a Hb range of approximately 12–14 g/dL. In the study by Henke et al., target Hb levels were higher than this accepted level, and therefore may have contributed to the negative findings in this study. Becker et al. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2000;46:459–66. Henke et al. Lancet 2003;362:1255–60. Vaupel et al. In: Nowrousian MR, ed. Recombinant Human Erythropoietin (rhEPO) in Clinical Oncology. Berlin, Springer, 2002:127–46.

10 Anämie, Hypoxie und Ergebnis einer Bestrahlung
Die Entwicklung einer Tumorhypoxie steht mit einer Anämie im Zusammenhang (Hb <13 g/dl)1,2 Hypoxische Regionen sind bei soliden Tumoren aufgrund einer unzureichenden Blutversorgung und hohem intratumoralem Sauerstoffverbrauch häufig. Molekularer Sauerstoff scheint hoch reaktive Hydroxylradikale, die eine DNA-Schädigung vermitteln, zu stabilisieren Zum Abtöten von Zellen ist unter hypoxischen Bedingungen im Vergleich zu Normalbedingungen das 2,5- bis 3,5-Fache der Standard-Bestrahlungsdosis erforderlich. Hypoxia is a known consequence of anemia, and has been linked with poor response to radiotherapy. Therefore, there may be a rationale for anemia treatment to help reverse hypoxia and improve the outcome of radiotherapy. 1. Brizel et al. Radiother Oncol 1999;53:113–17. 2. Becker et al. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2000;46:459–66.

11 Zusammenfassung zur Tumoroxygenierung
Nur für Anstiege der Hb-Werte, die zu einer Verbesserung der Tumoroxygenierung führen, ist eine günstige Auswirkung auf die Prognose zu erwarten. Bei höheren Hb-Werten (Hb >14 g/dl) ist ein erheblicher Anstieg der viskösen Resistenz innerhalb der chaotischen Mikrogefäße zu erwarten, was zu einer Nettoreduktion der Sauerstoffzufuhr führt (schlechte Tumoroxygenierung) Nur Anstiege bis zu den gegenwärtig empfohlenen Hb-Werten führen zu Verbesserungen der Tumoroxygenierung, was die Prognose verbessern kann. Summary of the relationship between tumor oxygenation and Hb levels.

12 Rekombinante Epoetine verschlechtern die Wirksamkeit einer CT bei Krebs nicht
Ergebnisse In Mammakarzinom-Zelllinien Eine EPO-Therapie beeinträchtigte die antiproliferativen und/oder zytotoxischen Wirkungen von Adriamycin, Taxol und Tamoxifen nicht Bei Mäusen Durch Zugabe von EPO zu Paclitaxel wurde das Therapieergebnis nicht beeinflusst Proliferation (% der Kontrollen) Proliferation (% der Kontrollen) Preclinical studies in breast cancer cell lines and a mouse xenograft model have also shown that epoetins do not counteract the effectiveness of chemotherapy. Keine Keine LaMontagne et al. Mol Cancer Ther 2006;5:347–55. Gewirtz et al. Clin Cancer Res 2006;12:2232–38.

13 Kenntnisse über den EPO-Rezeptor
Offene Fragen Gibt es auf Tumorzellen EPO-Rezeptoren? Ist der EPO-Rezeptor auf Tumorzellen funktionsfähig? Können ESA in vivo den EPO-Rezeptor auf Tumorzellen stimulieren? Unanswered questions concerning the expression and function of EPO receptors on tumor cells.

14 EPO-Rezeptoren (EPO-R) auf menschlichen Tumoren?
Indirekte Belege1,2 Elimination von IHC-Färbung des Tumors bei vorheriger Resorption von EPO-R In klinischen Studien lassen sich eine Verringerung des lokoregionalen PFS oder des Gesamtüberlebens in der mit ESA behandelten Gruppe beobachten Direkte Belege3 Demonstration eines EPO-R-Effekts in Tumorzelllinien oder Tumorproben mit polyklonalen Antiseren von Kaninchen (IHC) Förderung des Tumorzellwachstums und/oder Therapieresistenz in vitro The available evidence for the presence of epoetin receptors (EPO-R) on human tumor cells. The validity of these findings have been questioned, as the antibodies used to detect EPO-R are not specific, and cross-react with other proteins. 1. Osterborg et al. Eur J Cancer 2007;43:510–9. 2. Lai et al. J Clin Oncol 2006;24:4675–6. 3. Sinclair et al. Cancer 2007;110:477–88. IHC = Immunhistochemie.

15 Rekombinantes Epoetin ist nicht mit einem Tumorwachstum assoziiert
Präklinische Studien Untersuchung der EPO-Rezeptor-Expression und Auswirkung einer Therapie mit rekombinanten Epoetinen auf das Tumorwachstum Ergebnisse In Mammakarzinom-Zelllinien Es wurde eine EPO-Rezeptor-Expression nachgewiesen Es war keine spezifische Bindung von Epoetin an den Rezeptor zu beobachten, was darauf hinweist, dass der EPO-Rezeptor nicht funktionsfähig ist Eine Epoetin-Therapie führte nicht zu Tumorwachstum Epoetin löste keine physiologische Reaktion des Tumors aus (Proliferation, Migration, Signaltransduktion) In preclinical studies in breast cancer cell lines, epoetin treatment did not result in tumor growth. In addition, it could not be shown that epoetin binds to the receptor on breast cancer cells, indicating that the receptor may not be functional. LaMontagne et al. Mol Cancer Ther 2006;5:347–55. Gewirtz et al. Clin Cancer Res 2006;12:2232–38.

16 Präklinische Studien zur Auswirkung von ESA auf menschliche Tumoren
Die Mehrzahl der in-vitro- und in-vivo-Studien zeigte eine neutrale Auswirkung In einigen wenigen in-vitro- Studien zeigte sich eine gewisse Auswirkung auf die Proliferation und/oder Apoptoseresistenz Suprapharmakologische Konzentration von ESA Nicht statistisch signifikant; synchronisierte Zellen Nicht konsistent, was positive/negative Kontrollen betrifft Keine eindeutigen Belege für intrazelluläre Signalgebung Preclinical data do not support the hypothesis that ESAs contribute to tumor progression in the clinical setting. Osterborg et al. Eur J Cancer 2007;43:510–9.

17 Präklinische Daten deuten nicht auf eine Bedeutung von EPO-R für die Tumorprogression hin
Das EPO-R-Gen ist kein Onkogen, und eine Überexpression dieses Gens bringt für Tumoren keinen Selektionsvorteil EPO-R-mRNA-Spiegel sind in Tumorzelllinien nachweisbar, im Vergleich zu nicht tumorösen Geweben aber nicht erhöht Tumorzelllinien zeigen eine schwache oder nicht nachweisbare EPO- Bindung Eine Oberflächenexpression von EPO-R auf Tumoren wurde nicht zweifelsfrei gezeigt In den meisten klinischen Modellen zeigen sich verbesserte Ergebnisse (keine Tumorprogression in 23 unabhängigen Studien) Epoetin receptor studies indicate that the receptor may not be expressed on the surface of tumors. Sinclair et al. Cancer 2007;110:477–88.

18 Korrelation von EPO-R und EPO mit schlechtem Ergebnis?
60 80 40 20 100 Wahrscheinlichkeit für LDFS (%) Monate Placebo Epoetin beta Mit Risiko Placebo Epoetin beta p = 0,003 A Wahrscheinlichkeit für LDFS (%) Placebo Epoetin beta p = 0 ,36 B EPO-R pos. EPO-R neg. Zusätzliche Analyse einer Studie mit Bestrahlung ± EPO bei Karzinomen im HNO-Bereich EPO-R (unter Verwendung von C20 -Antiserum) korrelierte in der EPO-Studie mit einem schlechten Ergebnis Seren von 154 oder 351 Originalprobanden 2/3 exprimierten EPO-R Rezeptoraktivität nicht untersucht, nur Expression EPO-R-Expression lässt sich ohne Signaltransduktion zeigen HSP70-Kontrollen wurden nicht vorgestellt (falls durchgeführt) ‘Validierte’ eine Hypothese mit dem gleichen Datensatz, der zu ihrer Formulierung gebraucht wurde Sehr große Fehlerwahrscheinlichkeit für Beta-Fehler in der ‘EPO-R-negativen’ Gruppe Henke et al. raised concerns that ESAs may be associated with tumor proliferation, resistance to radiotherapy and reduced survival. The validity of these findings have been questioned because Patienten were treated beyond the approved target Hb level of ~12 g/dL The C20 antibody used to detect EPO-R is not specific to the EPO-R protein Receptor activity was not measured The presence of EPO-R on tumor cells could not be confirmed by other investigators Henke et al. J Clin Oncol 2006;24:4708–13.

19 Welche weiteren möglichen Erklärungen gibt es?
Anämie Hypoxie Chemotherapie-Resistenz Bestrahlungsresistenz Selektionsdruck  Genom-Instabilität  Angiogenese  Some other possible explanations for the negative results of the Henke study, including the role of anemia in causing hypoxia, which can increase chemo- and radioresistance. Maligne Progression Negative Auswirkungen auf das langfristige Ergebnis Vaupel et al. Med Oncol 2001;18:243–59.

20 Kommerzielle polyklonale Anti-EPO-R- Antikörper sind nicht spezifisch und weisen multiple Proteine nach Leerer Vektor Leerer Vektor EPOR EPOR The commercial antibodies previously used to detect EPO-R proteins are not specific and detect many other proteins of a similar size. Elliott et al. Blood 2006;107:1892–5.

21 Hitzeschockprotein 70 (HSP70)
Sehr gut erhaltene Familie von Chaperon-Proteinen, die in normalen Zellen durch Stress induziert werden und wichtige Funktionen für das Überleben der Zelle und die Apoptoseresistenz haben Die Expression wird bei vielen menschlichen Tumoren verstärkt Die Expression korreliert bei vielen Tumorarten (Bronchien, Mamma, HNO, Prostata, Darm, Magen, Blase) mit einem kürzeren Überleben und einer Therapieresistenz Die Expression wird unter hypoxischen Bedingungen verstärkt Eine Hinunterregulierung (z.B. Antisense) induziert den Tod von Tumorzellen Homologe Sequenz mit Antigen, das zur Bildung von polyklonalen Antikörpern C20 verwendet wird (insbesondere HSP70-2 und HSP70-5) Antibodies used to measure EPO-R protein levels also detect heat shock protein 70. HSP 70 expression is increased in many cancers. Viele der ‘EPO-R’, die mit C20 nachgewiesen werden, könnten auch HSP70-2 oder HSP70-5 sein Schmitt et al. J Leukoc Biol 2007; 81:15–27.

22 Zusammenfassung der Datenlage: ESA sind nicht mit Tumorwachstum/Proliferation assoziiert
Präklinische und klinische Daten sprechen nicht für die Hypothese, eine ESA-Therapie führe zu Tumorwachstum/-proliferation Der Antikörper, der zum Nachweis des EPO-Rezeptors verwendet wird, ist unspezifisch und weist auch das Hitzeschockprotein 70 nach ( HSP70-2, HSP70-5) In Modellen heterologer Transplantate wurde EPO-R auf der Plasmamembran von Tumorzellen nicht funktionell exprimiert In keiner Studie zeigte sich, dass pharmakologisch relevante ESA-Dosen das Tumorzellwachstum stimulieren ESA hatten keinen negativen Einfluss auf die Zytotoxizität einer CT Erythropoetin war nicht proangiogen und verstärkte die Metastasenentstehung nicht Data available to date do not support the hypothesis that ESA treatment results in tumor growth/proliferation. Laufende Studien werden Informationen zur Funktion von EPO-R bei Tumoren liefern

23 Zusammenfassung: Kenntnisse über EPO-R
Offene Fragen Gibt es auf Tumorzellen EPO-R? Rezeptoren lassen sich mit Hilfe eines unspezifischen Antikörpers auf Tumorzellen nachweisen EPO-R und HSP-70 haben sehr ähnliche Strukturen Ist der EPO-R auf Tumorzellen funktionsfähig? Es gibt keine Belege dafür, dass EPO-R oder HSP-70 durch ESA aktiviert werden Können ESA in vivo EPO-R auf Tumorzellen stimulieren? Es gibt keine Belege dafür, dass ESA innerhalb der zugelassenen Anwendungsgebiete bei Patienten mit CT Tumorzellen stimulieren Outstanding questions about the role of ESAs and the functionality of the EPO receptor in tumor progression. Current understanding suggests that quantification of EPO receptors may be complicated by the presence of specific heat shock proteins, and that there is no evidence linking ESAs, EPO receptors and tumor progression.

24 Kontrolle der Erythropoetin-Synthese
Verlust des Gleichgewichts Stimulus: Hypoxie aufgrund von verminderter Erythrozytenzahl, verminderter Verfügbarkeit von Sauerstoff im Blut oder gesteigertem Sauerstoffbedarf der Gewebe Normaler Sauerstoffgehalt Verlust des Gleichgewichts Erhöhung des Sauerstoff- gehalts des Plasmas Verringert den Sauerstoffgehalt des Plasmas Schematic of physiological control of endogenous erythropoietin synthesis. Erythropoetin stimuliert das Knochenmark Niere: Freisetzung von Erythropoetin Gesteigerte Erythropoese erhöht die Erythrozytenzahl

25 Veränderungen der endogenen Plasmakonzentrationen von Erythropoetin und Hb-Anstiege
Hämoglobin Endogenes Erythropoetin EPO mIU/ml Hb g/dl Changes in endogenous erythropoietin levels and Hb levels following onset of phlebotomy-induced anemia. After an initial rise, erythropoietin levels drop sharply. Findings suggest a deficiency in the regulation of erythropoietin production during acute anemia. Tage Modified from Al-Huniti et al. J Pharmacol Exp Ther 2004;310:202–8.

26 Liganden-induzierte Dimerisierung des EPO-R und nachfolgende Interaktion mit und Aktivierung von JAK2 Extrazellulär Plasma- membran Erythropoietin (EPO) exerts its effects by binding to its receptor (EPO-R) Binding of EPO to its receptor activates the protein tyrosine kinase JAK2. Intrazellulär JAK2: Januskinase 2 Damen et al. EMBO J 1995; 14:5557–68. Klingmuller et al. Cell 1995;80:729–38.

27 EPO-R-Aktivierung und Signaltransduktion
Activation of JAK2 is involved in the intracellular signalling pathway of EPO-R Inaktiver monomerischer Rezeptor Dimerischer Rezeptor und JAK2-Aktivierung Gen- transkription Beendigung der Signalgebung Damen et al. EMBO J 1995;14:5557–68. Klingmuller et al. Cell 1995;80:729–38

28 Internalisierung und Abbau des EPO-R-Komplexes
Erythropoetin Ubiquitin Phospho- tyrosin Intrazelluläre Signalgebung Following binding of EPO to the EPO-R and activation of the intracellular signalling pathway, the EPO-R complex is internalized by the cell and degraded. Modified from Walrafen et al. Blood 2005;105:600–8.

29 Bindungsaffinität von Epo alfa
Die Bindungsaffinität für Epoetin alfa ist 4-mal höher als für Darbepoetin Bindungsaffinität sinkt IC50 für die EPO-Rezeptor-Bindung (pM) Epoetin alfa Darbepoetin alfa Epoetin alfa has a binding affinity for the EPO-R 4-fold higher than that of darbepoetin. Elliott et al. Blood. 2000;96(abstract 352).