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Protein- Interaktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay Grundpraktikum Genetik.

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Präsentation zum Thema: "Protein- Interaktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay Grundpraktikum Genetik."—  Präsentation transkript:

1 Protein- Interaktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay Grundpraktikum Genetik

2 Analyse von Protein-Protein Interaktionen In vitro Methoden: –(Co-)Immunpräzipitation (zwei interagierenden Proteinen im Lysat) –Affinitätschromatographie (potentieller Interaktionspartner ist immobilisiert) –Cross-linking (chemische Verknüpfung von Partnern) –Protein-probing (markiertes Protein beweist eine Bindung) –Phage-display (Suche nach Partner in einer Bibliothek) –Protein-Chip In vivo Methoden: –Fluorescence energy transfer (FRET) –Hefe-Zwei-Hybrid –Hefe-Tribrid-System –Split-YFP

3 Saccharomyces cerevisiae 1996 Genomsequenz – 1. sequenzierter eukaryotischer Organismus ~ 12 Mb, 16 Chromosomen ~ 6000 Gene biotechnologische Nutzung Modellorganismus Genetik, Biochemie, Molekularbiologie Zellbiologie schnelles Wachstum, leicht zu kultivieren leichte Isolierbarkeit, Charakterisierung von Mutanten nicht pathogen stabiler haploider Zyklus transformierbar

4 Yeast-Two-Hybrid: GAL4 Transkriptionsfaktor keine Galaktose im Medium: Galaktose im Medium: GAL80 bindet an AD von GAL4 GAL80/GAL4 Komplex bindet an UAS bindet an den Promtor Transkription der GAL-Gene unterdrückt GAL4 bindet an Promotor Transkription der GAL-Gene aktiviert

5 Yeast-Two-Hybrid: Prinzip X = Bait = Protein für Identifikation von Bindungs- partner X = Prey = Target für Bait z.b. Bibliothek !!!! Verwendete Hefe-Stämme haben ein mutiertes (defektes) Gal4 !!!!

6 Yeast-Two-Hybrid: Prinzip β-Galactosidase ins Hefe-Genom integriert

7 Auxotrophie und Prototrophie auxotroph: bezeichnet Organismen, die bestimmte essentielle Substanzen nicht selbstständig synthetisieren können prototroph: bezeichnet Organismen, die alle benötigten organischen Wachstumsfaktoren (Aminosäuren, Nukleotide,…) selbst synthetisieren können

8 Yeast-Two-Hybrid: Hefestämme a-Zelle a-factor, α-Rezeptor α-Zelle α-factor, a-Rezeptor Klassische(genetische) Nomenklatur: ARG 2Wildtyp Gen arg2Mutiertes Gen arg2-9Spezifische Mutation in Gen arg2-ΔDeletionsmutante ARG2::LEU2Disruptionsmutante Arg2pProtein Arg+Arg prototroph Arg-Arg auxotroph

9

10 Yeast-Two-Hybrid: Plasmide

11 Yeast-Two-Hybrid: Transformation Transformation: Hitzeschock bei 42°C LiAC: erhöht Permeabilität und DNA-Bindekapazität der Zellwand carrier DNA: bindet an die Zellwand (einzelsträngige DNA bindet effektiver als doppelsträngige DNA) PEG: vermittelt Anlagerung des Plasmids und der carrier-DNA an Hefezellen

12 Yeast-Two-Hybrid: Transformation Wichtig: Unter der Cleanbench arbeiten Alle Lösungen und Platten nur unter der Bench öffnen Berechnung der Plasmidmenge (1 µg für Trafo) Bsp.: 129 ng/µl = Miniprep 1000 ng 129 ng/µl !! SD-Trp für Stamm AH109 und pGBKT7-constructs !! SD-Leu für Stamm Y187 und GADT7-constructs = 7,75 µl

13 Mating und Selecting

14 Testen auf Protein-Protein Interaktion

15 Mangelmedium – SD-Leu-Trp-His: low stringency medium Galaktosidase-Assay – α-Galaktosidase (MEL1): wird ins Medium sekretiert MEL1 UAS schwacher Promotor – β-Galaktosidase (lacZ): wird nicht sekretiert GAL1 UAS starker Promotor

16 Testen auf Protein-Protein Interaktion HIS3 Gen wurde in AH109 und Y187 durch eine spezifische Mutation ausgeschaltet aber: schwache Hintergrundexpression von HIS3 falsch Positive 3AT: 3 Amino-1,2,4 triazol kompetiver Inhibitor des HIS3 Genproduktes (Imidazolglycerol-Phosphat Dehydratase) !!! Selektives Medium ohne Histidin nötig !!!

17 Analyse von Protein-Protein Interaktionen Yeast-Two-Hybrid Analyse in S. cerevisiae Anwendungen: Interaktion zwischen Protein 1 und Protein 2 Interaktion zwischen Proteindomänen Rolle einzelner Aminosäurereste für Interaktion Identifizierung von neuen Interaktionspartnern

18 Vorteile/Nachteile des Yeast-Two-Hybrid Vorteile hoch sensitiv in vivo (keine biochemische Reinigung der Proteine nötig, postranslationale Modifizierungen) billig, robust Screening Nachteile Interaktionsstelle durch AD/BD Domäne verdeckt kann nur im Zellkern der Hefe stattfinden richtige Faltung, Stabilität der Proteine in der Hefezelle abweichende posttranslationale Modifizierungen in Hefe Protein ist toxisch für Hefe BD-Fusionprotein zeigen Interaktion (falsch Positive) zeitliche und räumliche Expression der Proteine

19 MADS-BOX Domain Proteine MADSIKC DNA- binding Protein-protein interaction Transcriptional activation

20 ABC Modell – Arabidopsis thaliana A

21 ABCDE Modell – Arabidopsis thaliana

22 Liriodendron tulipifera (tulip tree) Family: Magnoliaceae Flower: – Monoecious – 9 tepals small genom size (784 Mbp) Habitat: Eastern North America

23 Amborella trichopoda most basal angiosperm Family: Amborellaceae small, evergreen unisexual flower : – tiny, typically about 4-8 mm – 5 – 8 tepals – wind and insect pollination Habitat: New Caledonia A B A: female flower B: male flower

24 zu untersuchende Proteine Amborella trichopoda (AMTR) AMTR-AGL2 AMTR-PI AMTR-AG E function B function (GLO) C function Liriodendron tulipifera (LITU) LITU-DEF1 LITU-AGL2 LITU-PI B function E function B function (GLO)

25 Evolution des ABC-Models in Abhängigkeit von der Speziation der Blütenpflanzen. se-Sepalen, pe-Petalen, st-Stamina, ca-Carpell

26 Protein- Interaktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay 2. Tag

27 Auswertung 1. Tag ß-Galactosidase Assay Kolonie-PCR

28 Auswertung 1. Tag Kolonien zählen Wachstum? Was ist auffällig, anders als die Erwartung?

29 Kolonie-PCR Primer fwd Primer rv PCR PCR-Produkt Gel Zellaufschluss mit NaOH

30 Mastermix 1 x5,5 x (oder 6 x) Puffer 10 x5 µl27,5 µl dNTPs 2mM5 µl27,5 µl ddH 2 O34 µl187 µl Taq1 µl5,5 µl 45 µl (final 50 µl) Mischung enthält alle Komponenten um mehrere Reaktionen anzusetzen. Reduktion der Pipettierarbeit und des Fehlers! Bsp: 5 Reaktionen

31 ß-Galactosidase Assay Indigo Farbstoff wird nicht sekretiert Zellaufschluss mit Chloroform!!

32 ß-Galactosidase Assay Agarplatte Alufolie Chloroform Abdampfen lassen !!! + Agar mit X-Gal 3h – 24 h

33 Organisatorische Infos !!!!! Arbeiten mit Chloroform und EtBr !!!!! 3 Freiwillige zum Gele gießen Mittagspause nach dem X-Gal Test Praktikum Do und Fr Start pünktlich 8 Uhr Bitte das Skript runterladen und LESEN!! Fragen beantworten!!! Klausur am Freitag 15 Uhr – 16 Uhr


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