Protein-Interaktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay

Präsentation zum Thema: "Protein-Interaktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay"—  Präsentation transkript:

1 Protein-Interaktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay
Grundpraktikum Genetik

2 Analyse von Protein-Protein Interaktionen
In vitro Methoden: (Co-)Immunpräzipitation (zwei interagierenden Proteinen im Lysat) Affinitätschromatographie (potentieller Interaktionspartner ist immobilisiert) Cross-linking (chemische Verknüpfung von Partnern) Protein-probing (markiertes Protein beweist eine Bindung) Phage-display (Suche nach Partner in einer Bibliothek) Protein-Chip In vivo Methoden: Fluorescence energy transfer (FRET) Hefe-Zwei-Hybrid Hefe-Tribrid-System Split-YFP

3 Saccharomyces cerevisiae
1996 Genomsequenz – 1. sequenzierter eukaryotischer Organismus ~ 12 Mb, 16 Chromosomen ~ 6000 Gene biotechnologische Nutzung Modellorganismus Genetik, Biochemie, Molekularbiologie Zellbiologie schnelles Wachstum, leicht zu kultivieren leichte Isolierbarkeit, Charakterisierung von Mutanten nicht pathogen stabiler haploider Zyklus transformierbar

4 Yeast-Two-Hybrid: GAL4 Transkriptionsfaktor
keine Galaktose im Medium: Galaktose im Medium: GAL80 bindet an AD von GAL4 GAL80/GAL4 Komplex bindet an UAS bindet an den Promtor Transkription der GAL-Gene unterdrückt GAL4 bindet an Promotor Transkription der GAL-Gene aktiviert

5 Yeast-Two-Hybrid: Prinzip
X = Bait = Protein für Identifikation von Bindungs-partner X = Prey = Target für Bait z.b. Bibliothek !!!! Verwendete Hefe-Stämme haben ein mutiertes (defektes) Gal4 !!!!

6 Yeast-Two-Hybrid: Prinzip
β-Galactosidase ins Hefe-Genom integriert

7 Auxotrophie und Prototrophie
auxotroph: bezeichnet Organismen, die bestimmte essentielle Substanzen nicht selbstständig synthetisieren können prototroph: bezeichnet Organismen, die alle benötigten organischen Wachstumsfaktoren (Aminosäuren, Nukleotide,…) selbst synthetisieren können

8 Yeast-Two-Hybrid: Hefestämme
Klassische(genetische) Nomenklatur: ARG 2 Wildtyp Gen arg2 Mutiertes Gen arg2-9 Spezifische Mutation in Gen arg2-Δ Deletionsmutante ARG2::LEU2 Disruptionsmutante Arg2p Protein Arg+ Arg prototroph Arg- Arg auxotroph a-Zelle → a-factor, α-Rezeptor α-Zelle → α-factor, a-Rezeptor

9

10 Yeast-Two-Hybrid: Plasmide

11 Yeast-Two-Hybrid: Transformation
Transformation: Hitzeschock bei 42°C LiAC: erhöht Permeabilität und DNA-Bindekapazität der Zellwand carrier DNA: bindet an die Zellwand (einzelsträngige DNA bindet effektiver als doppelsträngige DNA) PEG: vermittelt Anlagerung des Plasmids und der carrier-DNA an Hefezellen

12 Yeast-Two-Hybrid: Transformation
Wichtig: Unter der Cleanbench arbeiten Alle Lösungen und Platten nur unter der Bench öffnen Berechnung der Plasmidmenge (1 µg für Trafo) Bsp.: 129 ng/µl = Miniprep 1000 ng 129 ng/µl !! SD-Trp für Stamm AH109 und pGBKT7-constructs !! SD-Leu für Stamm Y187 und GADT7-constructs = 7,75 µl

13 Mating und Selecting

14 Testen auf Protein-Protein Interaktion

15 Testen auf Protein-Protein Interaktion
Mangelmedium SD-Leu-Trp-His: low stringency medium Galaktosidase-Assay α-Galaktosidase (MEL1): wird ins Medium sekretiert MEL1 UAS schwacher Promotor β-Galaktosidase (lacZ): wird nicht sekretiert GAL1 UAS starker Promotor

16 Testen auf Protein-Protein Interaktion
HIS3 Gen wurde in AH109 und Y187 durch eine spezifische Mutation ausgeschaltet aber: schwache Hintergrundexpression von HIS3 → falsch Positive 3AT: 3 Amino-1,2,4 triazol kompetiver Inhibitor des HIS3 Genproduktes (Imidazolglycerol-Phosphat Dehydratase) !!! Selektives Medium ohne Histidin nötig !!!

17 Analyse von Protein-Protein Interaktionen
Yeast-Two-Hybrid Analyse in S. cerevisiae Anwendungen: • Interaktion zwischen Protein 1 und Protein 2 • Interaktion zwischen Proteindomänen • Rolle einzelner Aminosäurereste für Interaktion • Identifizierung von neuen Interaktionspartnern

18 Vorteile/Nachteile des Yeast-Two-Hybrid
hoch sensitiv in vivo (keine biochemische Reinigung der Proteine nötig, postranslationale Modifizierungen) billig, robust Screening Nachteile Interaktionsstelle durch AD/BD Domäne verdeckt kann nur im Zellkern der Hefe stattfinden richtige Faltung, Stabilität der Proteine in der Hefezelle abweichende posttranslationale Modifizierungen in Hefe Protein ist toxisch für Hefe BD-Fusionprotein zeigen Interaktion (falsch Positive) zeitliche und räumliche Expression der Proteine

19 MADS-BOX Domain Proteine
K C DNA- binding Protein-protein interaction Transcriptional activation

20 ABC Modell – Arabidopsis thaliana

21 ABCDE Modell – Arabidopsis thaliana

22 Liriodendron tulipifera (tulip tree)
Family: Magnoliaceae Flower: Monoecious 9 tepals small genom size (784 Mbp) Habitat: Eastern North America

23 Amborella trichopoda most basal angiosperm Family: Amborellaceae
small, evergreen unisexual flower : tiny, typically about 4-8 mm 5 – 8 tepals wind and insect pollination Habitat: New Caledonia A B A: female flower B: male flower

24 zu untersuchende Proteine
Amborella trichopoda (AMTR) AMTR-AGL2 AMTR-PI AMTR-AG E function B function (GLO) C function Liriodendron tulipifera (LITU) LITU-DEF1 LITU-AGL2 LITU-PI B function

25 Evolution des ABC-Models in Abhängigkeit von der Speziation der Blütenpflanzen.
se-Sepalen, pe-Petalen, st-Stamina, ca-Carpell

26 Protein-Interaktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay
2. Tag

27 ß-Galactosidase Assay Kolonie-PCR
2. Tag Auswertung 1. Tag ß-Galactosidase Assay Kolonie-PCR

28 Was ist auffällig, anders als die Erwartung?
Auswertung 1. Tag Kolonien zählen Wachstum? Wachstum? Wachstum? Was ist auffällig, anders als die Erwartung?

29 Kolonie-PCR Zellaufschluss mit NaOH Primer fwd PCR Primer rv Gel
PCR-Produkt

30 Mastermix Mischung enthält alle Komponenten um mehrere Reaktionen anzusetzen. Reduktion der Pipettierarbeit und des Fehlers! Bsp: 5 Reaktionen 1 x 5,5 x (oder 6 x) Puffer 10 x 5 µl 27,5 µl dNTPs 2mM ddH2O 34 µl 187 µl Taq 1 µl 5,5 µl 45 µl (final 50 µl)

31 ß-Galactosidase Assay
Indigo Farbstoff wird nicht sekretiert Zellaufschluss mit Chloroform!!

32 ß-Galactosidase Assay
Agarplatte Alufolie Chloroform Abdampfen lassen !!! Chloroform + Agar mit X-Gal 3h – 24 h

33 Organisatorische Infos
!!!!! Arbeiten mit Chloroform und EtBr !!!!! 3 Freiwillige zum Gele gießen Mittagspause nach dem X-Gal Test Praktikum Do und Fr Start pünktlich 8 Uhr Bitte das Skript runterladen und LESEN!! Fragen beantworten!!! Klausur am Freitag 15 Uhr – 16 Uhr