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Molekulare Diagnostik 1 Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss SNP-Genotypisierung SNP: Single Nucleotide Polymorphism.

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1 Molekulare Diagnostik 1 Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss SNP-Genotypisierung SNP: Single Nucleotide Polymorphism 99,9% der DNA Sequenzen aller Menschen sind ident. 80% der verbleibenden 0,1% entsprechen SNPs. SNP nennt man den Austausch einer einzelnen Base: Bsp.: GAACCT wird zu GAGCCT SNP kommt etwa alle bp im Genom vor. Damit gibt es etwa Millionen potentielle SNPs. 4 Millionen sind bereits identifiziert

2 Molekulare Diagnostik 2 Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss Vererbung von SNP Meist nicht als einzelne SNPs sondern als Blöcke (benachbarte SNPs) vererbt Blöcke bezeichnet man als Haplotyp Haplotyp Blöcke werden über Generationen ohne Rekombination weitervererbt (Stammbaumnachweis, Evolutionsnachweis, Populationsstudien) Sprich, auch wenn ein Block viele SNPs enthält, reicht die Identifizierung einiger SNPs um Haplotyp zu identifizieren

3 Molekulare Diagnostik 3 Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss Verbreitete Krankheiten und dazugehörendeSNPs Die meisten Krankheiten werden nicht von einzelnen SNPs hervorgerufen, sondern durch komplexe Interaktionen mehrerer Gene, Umweltfaktoren und Lebensstil. Zusammenhänge zwischen Krankheit und SNPs bzw. Haplotypen werden immer wichtiger für Diagnose. Umso mehr Krankheiten bestimmten SNPs/Haplotypen zugeordnet werden können, umso einfacher wird ihre Diagnose. Diagnose durch Analyse spezifischer SNP-Muster

4 Molekulare Diagnostik 4 Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss SNPs und biologische Effekte SNPs sind verantwortlich für: -Beneficial Drug Response -Adverse Drug Response

5 Molekulare Diagnostik 5 Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss SNP abhängiger Response Mensch und Tier: Medikamente führen zum gewünschten Erfolg: Heilung, Repression, Linderung (benef drug resp) Medikamente führen zu keiner Besserung oder überhaupt zum Tod (adverse drug resp) Pflanzen: genet. Manipulation von/durch SNPs könnte Erntertrag erhöhen Vorteil: Reduktion von Herbiziden, Insektiziden, Kunstdünger Bakterien/Viren: SNPs verursachen Medikamentenresistenz (Krankenhauskeime!!!) HIV ist schwer zu behandeln, weil Mutationsfrequenz des Virus in den SNPs sehr hoch

6 Molekulare Diagnostik 6 Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss Diagnose von SNPs Allel Spezifische (Oligonukleotid) Hybridisierung Allel Spezifische Oligonukleotid Ligation Primer Verlängerung Sequenzierung bestimmter DNA-Fragmente

7 Molekulare Diagnostik 7 Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss Allel Spezifische Hybridisierung (AS oder ASO) Testprinzip: Unterscheidung zweier DNA Moleküle, die in einer Base variieren, mittels Hybridisierung. Floureszenz markierte PCR Produkte werden zu immobilisierten Oligonukleotiden (=SNP Sequenzen) gegeben. Hybridisierung erfolgt extrem stringent (was nicht exakt bindet wird weggewaschen). Hinterher wird die Intensität der Floureszenz gemessen.

8 Molekulare Diagnostik 8 Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss Allel Spezifische Hybridisierung (AS oder ASO) Zugabe floureszenzmarkierter PCR Produkte zu immobilisierten Oligos (SNPs), Bindg. sehr stringent. Floureszenz indirekt prop.

9 Molekulare Diagnostik 9 Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss Allel Spezifische Oligonukleotid Ligation Es werden Oligos designt, die komplementär zur Zielsequenz (zu untersuchende Sequenz, durch PCR hergestellt) sind. Am 5´oder 3´Ende dieses Oligos befindet sich die allelspezifische Base Liegt ein SNP vor: Oligonukleotid ligiert nicht an Zielsequenz Liegt kein SNP vor: Oligonukleotid ligiert an Zeilsequenz

10 Molekulare Diagnostik 10 Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss Allel Spezifische Oligonukleotid Ligation

11 Molekulare Diagnostik 11 Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss Primer extension Das zu untersuchende Gen wird wiederum mittels PCR amplifiziert Daraufhin folgt eine Einzelbasen-Sequenzierung Terminatoren Didesoxynukleotide (verhindert weiteren Anbau von Basen)

12 Molekulare Diagnostik 12 Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss Allel Spezif. Primer Extension

13 Molekulare Diagnostik 13 Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss Sequenzierung gewisser DNA- Fragmente Das Sequenzieren ist meist die Untersuchungsmethode der Wahl bei SNPs Zwei Möglichkeiten der Primer Verlängerung: a) dye-Primers und unmarkierte Terminatoren b) Unmarkierte Primer und dye-Terminatoren Die Produkte der Reaktion werden dann mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt.

14 Molekulare Diagnostik 14 Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss Sequenzierung bestimmter DNA-Fragmente 1. Sequenz: WT homozygot 2. Sequenz: SNP homozygot 3. Sequenz: 1 Allel mit SNP, 1 Allel ohne Mutation Sequenz zeigt typischen Haplotyp, gleich mehrere SNPs als Block nebeneinander!!


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