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9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 1 Target Identification and Animal Models Das menschliche Genom könnte nach optimistischen Schätzungen.

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Präsentation zum Thema: "9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 1 Target Identification and Animal Models Das menschliche Genom könnte nach optimistischen Schätzungen."—  Präsentation transkript:

1 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 1 Target Identification and Animal Models Das menschliche Genom könnte nach optimistischen Schätzungen 5000 bis neue drug targets enthalten. Alle jemals eingesetzten Medikamente zielten auf etwa 500 targets auf molekularer Ebene ab. Aktuell kommen auf alle Medikamente am Markt nur 120 targets. Die 100 meist verkauften Medikamente zielen gar nur auf 43 Proteine ab. Gibt es also nur wenige sog. valid targets ? Gibt es zu wenig Information über sog. drugable targets ?

2 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 2 Innovation vs. me too Neue chemische Verbindungen (new molecular entities) und neuartige targets Lit: B.P.Zambrowicz & A.T.Sands Nature Rev.Drug Disc. 2 (2003) 38 COX2 Arthritis celecoxib PDE5 Erectile dysfunction sildenafil BCR-ABL Leukämie imantinib Die meisten NMEs zielen auf bereits bekannte targets ab. Aber: müßen besser als bestehende Verbindungen sein, um zugelassen zu werden.

3 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 3 Typische Targets im Genom Anteil am menschlichen Genom und Pharmaka am Markt Bisher etwa 500 Enzyme als targets benutzt. Möglicherweise potentielle targets im Genom

4 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 4 Typische Targets Aufteilung der auf dem Markt befindlichen Pharmaka bezüglich ihrer biochemischen targets Quelle: Hopkins & Groom, Nat.Rev.Drug.Disc. 1 (2002) 727

5 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 5 Validierung von targets Wann ist ein auf genetischer Ebene identifiziertes target tatsächlich auch brauchbar ? Exprimierierung Disease model Animal model Es muß geklärt werden ob sich das target als therapeutic target eignet und so ein valid target ist. defined physiological and clinical endpoints An dieser Stelle setzen dann Proteomics, Metabolomics und Pharmacogenetics / genomics an.

6 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 6 Informationsfluß in einer drug discovery pipeline Bioinformatik

7 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 7 Auf dem Weg zum target (I) Für den Fall einer bekannten Krankheit ist die Identifizierung eines geeigneten targets ein konvergenter Prozeß Lit: M.A.Lindsay Nature Rev.Drug Disc. 2 (2003) 831

8 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 8 Auf dem Weg zum target (II) Verwendete Techniken zur Identifizierung von targets Lit: M.A.Lindsay Nature Rev.Drug Disc. 2 (2003) 831 RNA target protein DNA Exprimierung Modifikationen

9 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 9 Auf dem Weg zum target (III) Forward genetics: Screening von Verbindungen gegen Variationen des Phänotyps und Mutationen Lit: M.A.Lindsay Nature Rev.Drug Disc. 2 (2003) 831

10 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 10 Auf dem Weg zum target (IV) Reverse genetics: Veränderung des Genotyps durch selektive Mutationen Lit: M.A.Lindsay Nature Rev.Drug Disc. 2 (2003) 831 Animal model Identified geneorthologues genes

11 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 11 Auf dem Weg zum target (V) Der Bioinformatische Ansatz zu neuen targets im Idealfall (Analysten Scenario) In der Praxis stellt sich vor allem die Frage: Nach welchen Genen muß man suchen ? Lit: A.T. Sands Nature Biotech. 21 (2003) 31

12 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 12 Nach was muß man also im Genom suchen? Die Chance, innovative targets zu finden sollte die Suche nach den folgenden targets bieten, die bisher unter- repräsentiert sind: Kinasen und Proteasen Transmembranproteine (GPCRs, Ionenkänale, Transporter) DNA, RNA Bindungsstellen Nukleare Rezeptoren (für Hormone) (insb. orphan nuclear receptors siehe Vorlesung 10, bisher nur wenige neue gefunden) Nach vorsichtigen Schätzungen sollten sich etwa neue und wertvolle targets (vaild, drugable) finden lassen. Ähnlichkeiten mit bereits verwendeten targets

13 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 13 Target validation Wenn es in hinreichend kausalem Zusammenhang mit der Krankheit steht: a)Als Enzym, GPCR, Ionenkanal, Rezeptor usw. Überprüfung durch screening mit Leitstrukturen aus focused libraries b)Als target auf DNA, RNA, mRNA Ebene selber Überprüfung durch knockout Mutationen (siehe unten), single point Mutationen (SNPs, siehe unten), und gene silencing mittels durch RNA interference (RNAi) (siehe siRNA) Wann ist ein target für therapeutische Zwecke tauglich, also valid ?

14 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 14 siRNA for target validation Dieser Effekt kann sowohl zum Stillegen von mRNA genutzt werden (gene silencing) als auch zum Aufspüren potentieller targets auf mRNA Ebene. Kurze RNA-Stränge von 11 bis 28 Nucleotiden können an komplementäre mRNA binden und zur deren Degradation durch RNAsen führen. Diese RNA Interferenz (RNAi) dient in Eukaryoten zur Abwehr von viraler RNA. Daraus leitet sich auch deren Bezeichnung als small interfering RNA (siRNA) ab. Lit: M.A. Lindsay Nature Rev. Drug Disc. 2 (2003) 831. Y.Dorsett & T.Tuschl ibid 3 (2004) 318. Der therapeutische Einsatz von siRNAs ist durch deren Stabilität (Applikationsform) und Selektivität (unspezifische Bindung) begrenzt.

15 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 15 target characterization Auch in den Genabschnitten die tatsächliche oder potentielle targets kodieren, kommen durchschnittlich mehr als 9 solcher Basenaustauschungen vor. Daraus folgt: 1.Nicht jede Variation ist ein Defekt oder bedeutet eine Prädisposition (für eine Krankheit) 2.Die Auswahl potentieller targets wird nicht einfacher Im gesammten (menschlichen) Genom treten Variationen auf. Statistisch gesehen 1 Basenpaar pro 1330 Basenpaare macht etwa Unterschiede zwischen zwei nicht verwandten Individuen.

16 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 16 Pharmacogenetics & Pharmacogenomics Die kausale Zuordnung eines klinischen Phänotyps (Allel bzw. Krankheitsbild) zu einer genetischen Ursache wird durch die Vielzahl der möglichen / vorhandenen Variationen des Genotyps erschwert. Lit: D.B. Goldstein et al. Nature Rev. Genetics 4 (2003) 937. Als Polymorphismus bezeichnet man Allele die bei mindestens 1% der Population auftreten. D.h. diese Genotypen kommen regulär vor. Im Gegensatz dazu bezeichnet man Veränderungen des Genoms die seltener als 1% auftauchen nur als Mutationen. Sequenzierung der (in Frage kommenden) Genabschnitte bei möglichst vielen Individuen.

17 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 17 Single Nucleotide Polymorphism Die Wahrscheinlichkeit durch Sequenzierung SNPs bestimmter Häufigkeit zu finden läßt sich wie folgt abschätzen: SNPs sind Unterschiede einer einzelnen Base in der DNA die innerhalb einer Population auftauchen. AnzahlSNP Häufigkeit Individuen>1%>2%>5%>10%>20% 2 4% 8% 19% 34% 59% 5 10% 18% 40% 65% 89% 10 18% 33% 64% 88% 99% 20 33% 55% 87% 99%>99% 40 55% 80% 98%>99%>99% Quelle: J.J. McCarthy Turning SNPs into Useful Markers of Drug Response in Pharmacogenomics, J.Licinio & M.-L.Wong (Eds.), Wiley-VCH (2002) pp

18 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 18 Multiple SNPs Lit. P.C.Sham et al. Am.J.Hum.Genet. 66 (2000) R.Weinshilboum & L.Wang Nature Rev.Drug Discov. 3 (2004) 739. Noch schwieriger ist die kausale Zuordnung einer Reaktion auf ein Medikament, wenn verschiedene von einander unabhängige SNPs vorhanden sind. D.h. wenn keine schlüßige Hypothese vorhanden ist. Die Zahl der zu sequenzierenden Genabschnitte kann dadurch undurchführbar groß werden. Als Beispiele für sog. valid biomarkers hat die US FDA bisher nur den Polymorphismus von CYP2D6 (Cytochrome P450) und TPMT (Thiopurine S-methyl-transferase) herausgestellt. Beide Enzyme sind maßgeblich an der metabolischen Umsetzung vieler Medikamente beteiligt. Mehr zum Polymorphismus von CYP2D6 in Vorlesung 10

19 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 19 Sukzesible Gene Lit. V.D.Schmith et al. Cell.Mol.Life Sci. 60 (2003) Bisher hat man sukzesible Gene im Zusammenhang mit folgenden Krankheitsbildern identifiziert: Herztod Neurodegenerative Krankheiten (Demenz, Alzheimer,...) Epilepsie Schizophrenie Diabetes Arthritis Lungenkrankheiten (Cystische Fibrose) Übergewicht

20 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 20 Gene Candidate Studies Lit. H.Z.Ring & D.L.Kroetz Pharmacogenomics 3 (2002) Besonders empfehlenswerter Review Prinzipielle Vorgehensweise bei potentiellen Gen-Kandidaten Auswahl des pharmazeutischen target Gens, entweder bekanntes target (Enzym, Transporter, pathogenes Gen,..) oder neu identifiziertes Gen aus DNA-Microarrays (auf mRNA Ebene), Proteomics (auf Proteinenebene), Bioinformatik Identifizierung von SNPs im ausgewählten Gen durch SNP-Mapping in größerem Maßstab, Bestimmung der Allel- Häufigkeit und ethnischen Verteilung, Analyse der Haplotypen Genotypisierung von SNPs in klinischen Studien Identifizierung der Patientenpopulation, Statistische Analyse

21 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 21 Warum Tiermodelle ? Zur in vivo Verifikation des Krankheitsmodelles Zum in vivo screening

22 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 22 Modellorganismen Bevor man Mäuse und andere Säugetiere zum in vivo screening verwendet, werden andere Modellorganismen herangezogen die über entsprechende orthologe Gene verfügen. Literatur : R. Knippers Molekulare Genetik 8. Auflage S Modellorganismen, Knockout Technologie Größere Zahl an zum Menschen orthologer Gene Zunehmend komplexere Organismen Steigender Aufwand und Kosten bei Experimenten

23 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 23 Was leisten animal models ? Zur in vivo Überprüfung eines Krankheitsmodelles können Tiermodelle hilfreich sein. 1. Vergleich des targets in Tier- und menschlichem Genom. 2. Erzeugung von knockout Mutanten / transgenen Tieren Das Vorhandensein eines adäquaten Tiermodelles ist praktisch immer die Voraussetzung für die weitere Entwicklung zum Medikament. Literatur zu transgenen Mäusen: R. Knippers Molekulare Genetik 8. Auflage S. 522 Textbox Plus 18.2

24 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 24 Warum mus musculus als Tiermodell ? (I) Zu 99% aller Mausgene konnten homologe bzw. orthologe Gene im Menschen identifiziert werden. Lit: Nature 420 (2002) Ausgabe 6915 vom Mouse Genome Sequencing Consortium ibid pp Vergleich gemeinsamer Elemente in Mensch und Maus Chromosomen

25 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 25 Warum mus musculus als Tiermodell ? (II) Damit sind von allen in Frage kommenden Modellorganismen Mäuse als Säugetiere am nächsten verwandt Mäuse haben eine rasche Generationsfolge: Mäuse sind mit 10 bis 12 Wochen geschlechtsreif. 22 bis 24 Tage nach der Paarung kommen 4 bis 8 Junge zur Welt, und das 5 bis 6 Mal im Jahr. Eine einzige Maus kann im Jahr gut 40 Junge haben. Die verwendeten Zuchtlinien sind genetisch gesehen relativ homogen (hoher Grad an Inzucht) Bisher gelingt die Erzeugung homozygoter transgener Mäuse leichter als bei Ratten (Rattus norvegicus oder norwegicus)

26 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 26 KO-mouse models (I) Bedeutung von knockout Mausmodellen im pharmazeutischen Bereich: Quelle: A.T.Sands Nature Biotech. 21 (2003) 31 Medizinische Umsatz Anzahl Anzahl Kategorie (2001 in Mio.US$)targets Medikamente Immunologie Neurologie/Psychatrie Cardiology Gastroenterologie Metabolismus Onkologie Hematologie

27 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 27 KO-mouse models (II) Beispiele für den Einsatz von knockout Mausmodellen in erfolgreichen Medikamenten: TargetsMedikamentMaus Phänotyp zeigt: Protonenpumpe Lansoprazolneutraler Magen pH Histamine H1-RezeptorFamotidine Magensäure Sekretion unterdrückt ACE Enalaprilniedriger Blutdruck AT 1 -Rezeptor Losartan dito COX2 Celecoxib verringerte Entzündungen COX1 und COX2Diclofenacweniger Schmerzen Lit: B.P.Zambrowicz & A.T.Sands Nature Rev.Drug Disc. 2 (2003) 38

28 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 28 Modellorganismen für Bluthochdruck Bei Mäusen ist Bluthochdruck praktisch nicht bekannt. Durch knock-in Mutationen übertrug man die Gene des Renin und Angiotensin Systems von Ratten auf Mäuse (vgl. Vorlesung 2) Lit: Li-Na Wei Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol. 37 (1997) 119. Lit: H.Ohkubo et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 (1990) Da aber Ratten für funktionelle Studien besser geeignet sind, wurden auch transgene Ratten erzeugt, die das Ren-2 Gen erhielten und dadurch starke Symptome des Bluthochdrucks zeigten die wiederum mittels ACE-Inhibitoren und Angiotensin-II Antagonisten therapierbar waren. Lit: J.J.Mullins et al. Nature 344 (1990) 541. Umgekehrt zeigen knockout Mäuse bei denen das ACE Gen fehlt, niedrigen Blutdruck. Lit: J.H.Krege et al. Nature 375 (1995) 146.

29 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 29 Modellorganismen für Krebs In der Krebsforschung spielen zwei Bereiche eine wesentliche Rolle: Der Mechanismus der Entstehung von Krebs und die therapeutische Effizienz der verschiedenen Medikamente. Dabei wurden eine ganze Reihe transgener Mausmodelle entwickelt, die eine erhöhte Sukzeptibilität für bestimmte Krebsarten zeigen. Generell scheinen bei Mäusen aber Tumore sowieso die häufigste Todesursache zu sein, wenn man andere Faktoren bei der Haltung ausschließt. Auf die (ethische) Problematik der Patentierbarkeit transgener Tiere an sich (ohne Anwendungsbezug) sei an dieser Stelle nur hingewiesen.

30 9. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 30 Weitere Tiermodelle Höhere Säugetiere wie Maus, Ratte, Kaninchen, Hund, Schwein werden häufig auch zum Test auf metabolische und toxikologische Eigenschaften von Verbindungen eingesetzt. Insbesondere der Vergleich von Screening Ergebnissen der metabolischen Umsetzung von Wirkstoffen mit denen aus in E. coli exprimierten CYP P450 Enzymen ist interessant, um das geeignete Tiermodell auszuwählen. Zukünftig dürfen sich allein schon aus Kostengründen transgene Mäuse das bevorzugte Tiermodell bleiben.


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