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1. Prinzip und wichtige Termini 2. RNA Präparation und Qualitätskontrolle 3. Datenauswertung 4. Kosten 5. Protokolle 6. Informationen für Kooperationspartner.

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1 1. Prinzip und wichtige Termini 2. RNA Präparation und Qualitätskontrolle 3. Datenauswertung 4. Kosten 5. Protokolle 6. Informationen für Kooperationspartner 7. Downloads Einführung in die Genexpressionsplattform des IVM

2 1. Prinzip und wichtige Termini Die humanen, murinen u.a. Genomprojekte und die Verfügbarkeit robuster Hardware- und Software-Plattformen zur Herstellung und Auswertung von Microarrays ermöglichen genomweite Genexpressionanalysen, d.h. die Quantifizierung aller mRNAs (> ) eines RNA Extrakts relativ zu einem zweiten RNA Extrakt, in 48 Stunden. Die Plattform des IVM (Firma Affymetrix) ist mit einem Hybridisierungsofen, einer Waschstation, einem Scanner und Software ausgerüstet. Letztere erlaubt die mathematischen, statistischen und informationstechnologischen Auswertungen der Arrays. 1.Prinzip und wichtige Termini

3 Affymetrix bietet für mehrere Organismen Expressionsarrays an.Expressionsarrays Diese werden in verschiedenen Formaten angeboten. Je nach Format und Protokoll werden 0,5 - 5 µg RNA für einen Array benötigt. 1. Prinzip und wichtige Termini Verschiedene Spezies können untersucht werden

4 1. Prinzip und wichtige Termini Grundlage der Arraytechnologie sind die Sequenzinformationen der verschiedenen Genomprojekte. Mittels Photolithographie werden auf einer Glasoberfläche 25mer - sogenannte Perfect Match Oligonukleotide (ON) synthetisiert. Neben jedem Perfect Match ON wird ein sogenanntes Miss Match ON, das gegenüber dem Perfect Match ON einen Nukleotidaustausch in Position 13 enthält, synthetisiert. Daraus ergeben sich Perfect Match - Miss Match ON Paare, die sogenannten Probe Pairs. Die Signale des Miss Match ONs werden vom Perfect Match ON abgezogen. Hierdurch werden Sensitivität und Spezifität erhöht. Jede RNA Sequenz ist durch ein Probe Set, bestehend aus 11 solcher Probe Pairs, repräsentiert. Dies ermöglicht eine statistische Aussage über die Qualität des Messwertes.Photolithographie Die Herstellung der Arrays

5 1. Prinzip und wichtige Termini Probe Set Probe PairFeature Miss Match (MM) Perfect Match (PM) Nucleotidaustausch an Pos. 13 Das Prinzip Probe Set

6 Synthese der Sonden oder Proben 1. Prinzip und wichtige Termini

7 Fluidics Station 1. Das Prinzip und wichtige Termini Der Waschvorgang und das Scannen

8 Interne Kontrollen der Arrays Background und Noise Scanner Elektrik und Hybridisierung Percent present Probenqualität und Reproduzierbarkeit Spiked oligo controls Hybridisierung, Färbung (Effizienz und Linearität) Verhältnis verschiedener Housekeeping Gene Qualität der cRNA insgesamt poly(A)-RNA spikes Qualität der cRNA Synthese 1. Das Prinzip und wichtige Termini

9 2. RNA Präparation und Qualitätskontrolle Wichtigste Voraussetzung für einen Array hoher Qualität ist eine hochwertige RNA. Degradation und Verunreinigungen müssen vermieden werden. Wir empfehlen den Qiagen RNeasy Lipid Tissue Mini Kit.RNeasy Lipid Tissue Mini Kit Zusätzlich kommt bei Geweben der Probengewinnung, Lagerung und Homogenisation eine besondere Bedeutung zu. Dies muß für jedes Gewebe gesondert evaluiert werden.

10 2. RNA Präparation und Qualitätskontrolle Schema der RNA Präparation

11 Die Stadien der RNA Degradation RNA Integrität mit dem Agilent System 28s - 18s ratio > RNA Präparation und Qualitätskontrolle Es sollten keine kurzen RNA Fragmente sichtbar werden

12 3. Datenauswertung Es gibt eine unüberschaubare Anzahl an Ansätzen. Welche man wählt, hängt von der experimentellen Fragestellung ab. Grundsätzlich unterteilt sich die Auswertung in 3 Stufen: Rohdatenauswertung mit Report zur Qualitätskontrolle Die statistische Auswertung und Filterung Die Annotation und funktionelle Auswertung.

13 Rohdatenanalyse GCOS Statistik Excel, GeneSpring Funktionelle Bewertung GeneSpring, NetAffx, Gene Ontology, GenMapp, RefSeq, Unigene Clustering GeneSpring, Bezug zu den Rohdaten herstellen Access, GeneSpring, Excel Ergebnisdarstellung GeneSpring, Excel, Fatigo Qualitäts- kontrolle GCOS (Report) Datenbank GCOS Manager 3. Datenauswertung Datenauswertung und verfügbare Tools

14 3. Datenauswertung Die Rohdatenanalyse mit der GCOS DAT-File CEL-File 7 x 7 Pixel pro Feature Eine Zahl pro Feature Ein Signal Wert mit Detection p-Wert pro Probeset CHP-File Zusätzlich wird ein Report erstellt, der alle relevanten Qualitätsparameter enthält

15 Der Call 3. Datenauswertung Die Analyse der Probe Pairs eines Probe Sets, d.h. eines Gens oder mRNA, führt durch die GCOS Software zum Call. Absent Call (nicht exprimiert): Detection p-Wert > 0,065 Marginal Call (eventuell exprimiert): Detection p-Wert 0, ,05 Present Call (exprimiert): Detection p-Wert < 0,05. Absent, present und marginal Calls ergeben sich aus Signalintensitäten von Hybridisierungssignalen, die mit Fehlern behaftet sein können. Calls sind deshalb nur vorläufige Beurteilungen, insbesondere müssen die marginal und absent Calls mit Vorsicht interpretiert werden und, bei Bedarf, durch RT-PCR überprüft werden.

16 Die Normalisierung Um die Daten verschiedener Arrays vergleichbar zu machen, müssen die Daten normalisiert werden. Hierzu gibt es viele verschiedene Möglichkeiten. Wir benutzen: Standard: Skalierung auf einen Zielwert von 500 am Mittelwert Bei Sättigung: Skalierung auf einen Zielwert 500 am Median Für Tests allgemein: Logarithmierung und Skalierung per Gen an der 50ten Perzentile 3. Datenauswertung

17 Der Scatter Plot Die einfachste Auswertung eines 2 Array Experiments (Kontrolle gegen Probe) ist der Scatter Plot, bei dem die Ergebnisse der beiden Arrays logarithmisch gegeneinander aufgetragen werden. Rot: Present - Present; Gelb: Absent - Absent; Blau: Absent - Present FoldChange Linien, 2x, 3x, 10x und 30x Mehr als 30 fach differentiell exprimiertes Gen 3. Datenauswertung

18 Statistische Auswertung und Filterung Eine statistische Auswertung setzt wenigstens 3, besser 5, Wiederholungsmessungen voraus. Sie liefert ein zusätzliches Filterkriterium in Form des p-Wertes. Die Filterung reduziert die Datenflut. Die Schwellenwerte sind willkürlich.. Filter: 1. Signalwert 2. Detection p-Wert 3. Fold Change 4. p-Wert des Tests. Das Ergebnis ist eine Liste von Kandidatengenen, die mit erhöhter Wahrscheinlichkeit tatsächlich differentiell exprimiert sind. Durch die Stringenz der Schwellenwerte kann die Qualität der Kandidatenliste erhöht werden. 3. Datenauswertung

19 Reduzierte Streuung durch Mittelwertbildung 3. Datenauswertung

20 Filter

21 3. Datenauswertung Kombination der Filter: Ergebnisliste

22 Die Annotation Liste mit Affymetrix Nummern via Access, GeneSpring, NetAffxGeneSpringNetAffx Bezug zu Datenbank Termini - PubmedPubmed - UniGeneUniGene - LocusLink / Entrez GeneLocusLinkEntrez Gene - OMIMOMIM - EnsemblEnsembl -... Problem: Der Experimentator erhält eine Genliste, die unbekannte Gene enthält und ungeordnet ist: Ein schnelles Verfahren zur Informationsbeschaffung wird nötig. Datenbanken können weitere Informationen bereitstellen: 3. Datenauswertung

23 4. Die Kosten Die Kosten pro Array betragen bis Die exakten Kosten hängen vom Leistungsumfang und dem Arraytyp ab.

24 5. Die verschiedenen Protokolle Es kommen 6 verschiedene Protokolle zum Einsatz. Standard (S), Midi (M) und Small Scale (X), jeweils für die Arrayformate Standard (1) und Midi (2). Nachfolgende Übersicht zeigt, worin sich die Protokolle im wesentlichen unterscheiden: Protokoll:MA-S1MA-S2MA-M1MA-M2MA-X1MA-X2 Eingesetzte RNA Menge5 µg3 µg2 µg1 µg0,7 µg0,5 µg IVT-Zeit4 h 16 h 16+8 h Benötigte Menge an cRNA14 µg8,5 µg12 µg8 µg12 µg8 µg Hybridisierungsvolumen200 µl130 µl200 µl130 µl200 µl130 µl

25 6. Information für Kooperationspartner Vorgehen: Kontaktaufnahme per Mail: Besprechung und Beratung Übergabe der Proben mit Projektblatt (Vordruck aus IVM) Durchführung der Microarrays Übergabe der Daten als Rohdatenfiles und als Excelfiles (Eine Excel Vorlage zur Auswertung wird bereitgestellt)

26 7. Downloads Vertrag Excelvorlage zur Auswertung Manual zur Excelvorlage Vordruck Projektblatt


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