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Hans-Martin Jäck Abteilung für Molekulare Immunologie Medizinische Klinik III Nikolaus-Fiebiger-Zentrum Southern- und Northern- Blot-Analysen Gk-Methodenseminar.

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1 Hans-Martin Jäck Abteilung für Molekulare Immunologie Medizinische Klinik III Nikolaus-Fiebiger-Zentrum Southern- und Northern- Blot-Analysen Gk-Methodenseminar Erlangen, März 2007

2 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 2 Modifiziert aus Elelectrophoresis in Practice by Westermeier, 2 nd Edition DNA Migration Elektrophorese Transfer Nachweis Block Blocksubstanz Spezifische Sonde bzw. Antikörper Southern Übersicht: Blotting-Methoden Western Protein Northern RNA Southwestern Northwestern

3 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 3 Methode zum qualitativen (z.B. Größe) und quantitativen Nachweis spezifischer, immobilisierter DNA-Sequenzen Isolierung der DNA bzw. PCR-Amplifikation Restriktionsverdau isolierter DNA Agarosegelelektrophorese Transfer Hybridisierung mit spezifischer DNA-Sonde Signalentwicklung Southern-Blot-Analyse

4 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 4 Größen- Standard Modifiziert aus Recombinant DNA by Watson et al., 2 nd Edition Sonde hybridisiert mit komplementären Sequenzen RNA or DNA Gel Membran Transferierte DNA/RNA Elektrophorese Hybridisierung mit spezifischer radioaktiven Sonde Transfer Exponieren mit Röntgenfilm Filter im Gefrierbeutel Gel Puffer Schwamm Membran Filterpapier Autoradio- gramm Migration Markierung der Sonde Gewicht Übersicht: Southern-Blot-Analysen

5 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 5 Proteinase K/Phenol-Methode Zellen bzw. Gewebe in SDS-Puffer lysieren Verdau der RNA mit RNAse A/T1 Extraktion des Lysats mit Phenol und Phenol/Chloroform Verdau der Proteine mit Proteinase K/SDS Präzipitation der DNA mit Na-Acetat und EtOH auf Eis oder C/12 hrs Lösen der DNA in TE (10mM Tris pH=8.0 / 1mM EDTA) DNA Phenol DNA-Isolierung und -Quantifizierung

6 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 6 Ionenaustauschchromatographie nach Qiagen St - HindIII Sau3A Lyse cells in SDS buffer with ProtK and RNAse Apply to Resin Elute

7 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 7 QuelleDNA (mg) 1 Säugetierzelle: (= 5 pg) 10 6 kultivierte Zellen : mg Maus-Leber: ml Blut:1-10 Ausbeuten

8 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 8 µg/ml Nukleinsäure = OD 260 x Umrechnungsfaktor Umrechnungsfaktoren (für Küvette mit d = 1cm): ds-DNA:1 OD 260 Unit = 50µg/ml ssDNA:1 OD 260 Unit = 35µg/ml ssRNA:1 OD 260 Unit = 40µg/ml ss Oligonukleotide: 1 OD 260 Unit = 20µg/ml Quantifizierung und Reinheit isolierter Nukleinsäuren Gute DNA: OD 260 / OD 280 = Gute RNA: OD 260 / OD 280 = Photometrische Konzentrationsbestimmung Reinheit

9 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 9 Entdeckung und Eigenschaften Erkennen spezifische DNA-Sequenzen und schneiden entweder innerhalb (Typ II) oder außerhalb der Erkennungsstelle (Typ I) Ca. 3,000 Restriktionsenzyme mit ca. 230 Sequenzspezifitäten Hauptsächlich in Bakterien, aber auch in einigen Viren und Eukaryonten Host-controlled restriction modification bei Bakteriophagen (Luria, 1950), Erste Sequenz-spezifische Typ I Endonuklease (Arber and Linn sowie Meselson and Yuan, 1968) Erstes Typ II-Restriktionsenzym Hind II (Smith und Kollegen, 1970) Nobelpreis für Medzin an Werner Arber, Hamilton Smith und Daniel Nathans (1978) Mit Entdeckung der RE begann der Start der Molekuarbiologie Restriktionsenzyme

10 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 10 KpnI 5´-GGTNACC G GTNACC 3´-CCANTGG CCANTC-5´ G 5´-GGTACC GGTAC-3´ C 3´-CCATGG C CATGG 5´-CCCGGG CCC GGG 3´-GGGCCC GGG CCC XmaI BstEII Asp718I SmaI 5´-CCCGGG C CCGGG 3´-GGGCCC GGGCC-5´ C 5´-GGTACC G GTACC 3´-CCATGG CCATG-5´ G 3´ Überhang Blunt 5´ Überhang Isoschizomere Einige Beispiele von Typ II-Restriktionsenzymen

11 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 11 Mit der Entdeckung der Restriktionsenzyme begann die Entwicklung der Molekularbiologie. Sie ermöglichen die gezielte Herstellung von DNA-Fragmenten, die dann isoliert und zu neuen Konstruktionen zusammengesetzt werden können. Enzyme, die "sticky ends" erzeugen, sind dabei besonders hilfreich, da sich die überlappenden Enden leicht miteinander verbinden lassen. Für ihre grundlegenden Arbeiten zur "Entdeckung der Restriktionsenzyme und ihre Anwendung in der Molekulargenetik" bekamen Werner Arber, Daniel Nathans und Hamilton Othanel Smith 1978 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin.Molekularbiologie Werner ArberDaniel NathansHamilton Othanel Smith1978Nobelpreis für Physiologie oder Medizin

12 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 12 Enzymatische Aktivität von Restriktionsenzymen Die Aktivität von RE wird in Units [U] angegeben 1U entpricht der Menge an Enzym, das 1 ug Phagen-DNA (ca. 45kb) in 1 Stunde unter optimalen Temperatur- und Pufferbedingungen verdaut

13 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 13 Ethidiumbromid (EtBr)-Färbung Interkaliert zw. Basen Bindung ist proportional zur Fragmentlänge EtBr löst Fluoreszenz- löschung von eingestrahl-tem UV-Licht aus Fragmente orangerot (Empfindlichkeit: 1-2ng DNA) EtBr-Färbung elektrophorestisch aufgetrennter genomische DNA Agarose-Gelelektrophorese

14 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 14 Glasplatte Nylon Membran Papiertücher Whatman Papier Gewicht: ~250 g Gel 10 x SSC Whatman Papier-Brücke Poröser Stein 20xSSC Wahl der Membran Kapillar-Transfer Aufbau Nitro- zellulose Nylon Bindunghydrophob (backen) Kovalent (UV) FragmenteDenaturiert > 300bp denaturiert > 50bp TransferKapillar Elektro SondenAllev.a radioaktiv markierte Sonden Bindungs- kapazität Hochgering

15 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 15 Fragmentierung durch Säure- und Alkalibehandlung (modifiziert aus: Knippers, Molekulare Genetik) Probleme Nur Einzelstrand-DNA bindet an Membran Große DNA-Fragmente (> 10kb) transferieren schlecht 1. Fragmentieren 2. Denaturieren OH H+H+ Adenin Depurinierung durch Säure Spaltung der N-Glykosid-Bindung - OH Denaturierung und Spaltung durch Lauge Spaltung der Phospho- Diesterbindung)

16 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 16 Sonden Doppelsträngige (ds) DNA Einzelsträngige (ss) DNA Einzelsträngige (ss) RNA Oligonukleotide ( Basen) Verwendung markierter Desoxynukleotide während der Synthese bzw. Markierung fertig synthetisierter DNA und RNA-Fragmente sowie Oligos Prinzip Markierung der Sonde

17 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 17 Markierte Desoxynukleotide 2 Digoxigenin -dUTP Biotin-7 -dATP Biotin [ 32 P]-dATP Digoxigenin (adapted from α γ

18 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 18 * * * 5 3 Nick-Translation Random-Prime Markierungsmethoden 3 5 dsDNA-Sonde dsDNA-Sonde 5 3 Klenow + P*dNTP C 2.Hexa-dNTP-Gemisch Dnase I Kornberg Pol (3-5 Exo) * * * 3 5 Markierung Kornberg Pol (Pol) + P*dNTP

19 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 19 *** Endmarkierung In vitro Transkription3 Tailing Vektor mit Sondensequenz + T7-Promoter * * T7RNA-Pol + P*NTP dsDNA- Sonde * * 5-Kinase + P*dNTP TdT + P*dNTP 5 3 *** dsDNA- Sonde * Markierung

20 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 20 Spezifische Aktivität und chemische Konzentration Spezifische Aktivität z.B mCi pro mMol Chemische Konzentration mMol pro liter Konsequenz: Setzt man 100 mCi eines 32 P-markierten Fragments mit 3000mCi/mmol bzw. 300 mCi/mmol ein, so ist die chemische Konzentration des Fragments mit der höheren spezifischen Aktivität um das 10-fache geringer (Beispiel: Über Random-prime bzw. Nick-translation markierte Sonden)

21 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 21 Fixieren der transferierten Nukleinsäure (UV oder 80 0 C) Gel Membran Transferierte DNA/RNA 1. Prähybdridisierung 2. Hybridisierung 3. Waschen Hybridisierofen Einfrierbeutel Markierte Sonde Hybridisierung

22 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 22 Nachweis radioaktiv-markierter Sonden Belichten eines Röntgenfilms mit Verstärkerfolie Bei –70 0 C Verstärkerfolie Membran Röntgenfilm Autoradiogramm kb Nachweis der Hybridisierung

23 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 23 Photon Ag + Ag* Ag *Ag* t½=1sec Zur Entwicklung von aktivierten Silber- atomen (Ag * ) während der Filment- wicklung benötigt man mindestens zwei aktivierte Silberatome. Bei niedrigen Temperaturen ist die Halbwertszeit des ersten aktivierten Silveratoms größer. Dadurch erhöht sich die Wahr- scheinlichkeit, dass ein zweites aktivier- tes Ag-Atom entsteht, bevor das erste Silberatom wieder reduziert wird Einfluß der Temperatur Einfluß der Verstärkerfolie Membran Röntgenfilm Verstärkerfolie -Strahlung

24 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 24 Markierte Sonde Nachweis nicht-radioaktiv markierter Sonden Kolorimetrisch Immobilisiertes Fragment AP Avidin AP Ak Biotin Digoxigenin Redoxreaktion mit reduziertem farblosen P-Substrat (z.B. NTB/BCIP-Reaktion)

25 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 25 Schematic of the NBT/BCIP reaction: when alkaline phosphatase (AP) removes the phosphate group of BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate) the resulting molecules dimerizes under oxidating conditions to give the blue precipitate (5, 5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo). During the reaction with BCIP, NBT (nitroblue tetrazolium) is reduced to its colored form to give an enhanced color reaction (adapted from Kolloquiumsunterlagen, Molekularbiologische Übungen,

26 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 26 Chemilumineszenz Schematic of the CSPD reaction: Enzymatic dephosphorylation of the dioxetane CSPD by alkaline phosphatase leads to the metastable phenolate anion, which decomposes and emits light at 477 nm. (adapted from Kolloquiumsunterlagen, Molekularbiologische Übungen, Gößl et al., Zentrum für Angewandte Genetik)

27 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 27 Verfizierung der Identität eines PCR Produktes bzw. DNA-Fragmentes Kartierung isolierter DNA-Fragmente Analyse von Intronsequenzen Nachweis von Genmutationen Nachweis von Genumlagerungen Nachweis der homologer Rekombinationen (gezielte Mutationen z.B. bei Mäusen) Anwendungen

28 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 28 Immunglobulin- bzw. T-Zellrezeptorgen-Umlagerungen Immunglobulin- bzw. T-Zellrezeptorgene werden durch Umlagerung von Gen- segmenten während der Reifung von B- und T-Zellen aus Blutstammzellen ge-bildet

29 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 29 Beispiel: Genumlagerung am Schwerkettengen-Lokus Kb S B +/- B +/+ Sonde Eco-Verdau + Sonde Sonde

30 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 30 J C 5 J Pst I 7-kb wildtype fragment (J k W) Pst I 5.7-kb targeted fragment (J k T) neo Pst I digest 5 J probe J W (7.0) J T (5.7) /- +/+ Wildtype Beispiel: Nachweis gezielter Mutationen in transgenen Mäusen Wildtype locus Targeted locus Aus: Kline et al, JI 1998

31 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 31 23,1 4, ,8 23,1 9,4 6,6 4,4 Wildtyp Klon 55Klon 59Klon 56Klon 53Klon 60 Klon 58Klon 57Klon 52 Klon 50Klon 54 ** EcoRI / Sonde A Nachweis gezielter Mutationen in Zellinien Aus: Dagmar Fuchs, Diplomarbeit 2001

32 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 32 Gendiagnostik Dia entnommen aus

33 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 33 Methode zum qualitativen (z.B. Größe !!!!) und quantitativen Nachweis spezifischer, immobilisierter RNA-Sequenzen RNA-Isolierung Denaturierung Agarosegelelektrophorese Transfer Hybridisierung Signalentwicklung Northern-Blot-Analyse

34 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 34 Eine eukaryontische Zelle enthält etwa 10 pg Gesamt-RNA ca % ribosomale RNA ca % tRNA and snRNA ca. 1-5% mRNA Typische Ausbeuten ( g) 10 6 Hela : COS NIH/3T mg Milz35 10 mg Hirn8 RNA-Isolierung

35 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 35 Vorsichtsmaßnahmen Handschuhe tragen (Haut ist kontaminiert mir RNAsen) RNAse-freie Reagentien separat im Labor lagern Verwendung steriler Einwegmaterialien (Zellkultur) Glasswaren sollten bei C gebacken werden Behandlung von deionisiertem Wasser mit 0.1% Diethylpyrocarbonat (DEPC, von Sigma) Gelkammern und andere Materielen für RNA-Arbeit reservieren Verwendung von RNase-Inhibitoren (Rnasin von Promega)

36 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 36 Erfolgreiche RNA-Isolierung (4-Punkte-Regel) 1.Inaktivierung der RNAse-Aktivität 2.Effektiver Zellaufschluß 3.Denaturierung der Nukleoproteinkomplexe 4.Entfernung von Protein und DNA OH + CHCl 3 S-C N 2 HN C NH 2 NH Guanidinium-Isothiocyanat (GIT) Phenol / Chloroform oInaktiviert RNAsen oGuter Zellaufschluß oZerstört Nukleoprotein- komplexe oZerstört Nukleoprotein- komplexes oExtrahiert DNA und denaturierte Proteine

37 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 37 Isolierung von Gesamt-RNA Lyse der Zellen bzw. Gewebe mit GIT/ -ME lysieren Extraktion des Lysats mit Phenol und Phenol/Chloroform Präzipitation der RNA mit Na-Acetat und EtOH auf Eis oder C/12 hrs Lösen der RNA in TE (10mM Tris pH=8.0 / 1mM EDTA) DNA RNA CsCl-Dichte-zentrifugation Lösen der RNA in TE (10mM Tris pH=8.0 / 1mM EDTA) Reinigen der RNA über Ionenaustauscher-Matrix (Qiagen, Promega) Reinheit: OD 260 / 280 =

38 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 38 Isolierung zytosolischer RNA Zellen bzw. Gewebe werden in nicht- ionischem Detergenz (NP-40, Triton X-100) lysiert RNA wird mit N a-Acetat und EtOH auf Eis oder bei C/12 hrs präzipitiert RNA wird in TE gelöst (10mM Tris pH=8.0 / 1mM EDTA) Reinheit: OD 260 / 280 = Kerne werden abzentrifugiert (Eppendorf, 13000g) Postnukleärer Überstand wird mit Phenol/Chloroform extrahiert

39 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 39 Isolierung von Kern-RNAmRNA-Isolierung - TTTTTT AAAAAA cap mRNA Oligo-dT Zellen mit nicht-ionischen Detergenz aufschließen Kerne über Sucrose- gradienten aufreinigen RNA über GIT-Methode und CsCl-Gradienten aufreinigen Zellen mit GIT aufschließen Affinitätschromatographie an oligo(dT)-Matrix Sepharose, Cellulose oder Magnet. Partikel

40 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 40 Einzelsträngige, isolierte RNA- Transkripte besitzen viele, thermodynamisch-stabile Sekundärstruktur Analog Southern-Methode, RNA muss aber denaturiert werden Schmier im Agarosegel Elektophorese und Transfer Formaldehyd Verhindert Wasserstoffbrücken- bindungen zwischen Basen und somit die Ausbildung einer Sekundärstruktur Denaturierte RNA-Fragmente haben keine Sekundärstruktur Scharfe Bande im Agarosegel

41 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 41 Beispiel: Formaldehyd-Agarose-Elektrophorese verschiedener RNA-Fraktionen aus Hybridomzellen HC +/- Hybridom HC-Sonde Aktin-Sonde EtBr Gesamt-RNA = GKern-RNA = KZytoplasma-RNA = Z

42 Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 42 Abbildung 2.9.2: Die beiden Methoden dienen dem Nachweis (und der Größenbestimmung) von spezifischer messenger-RNA oder Proteinen, die aus der Zelle isoliert wurden. (Northern.gif)


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