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© eibenglaubitz 2008 Fetale Zellen im maternalen Blut Bernd Eiben Institut für Labormedizin und Klinische Genetik Rhein Ruhr im Laborverbund wagnerstibbe.

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1 © eibenglaubitz 2008 Fetale Zellen im maternalen Blut Bernd Eiben Institut für Labormedizin und Klinische Genetik Rhein Ruhr im Laborverbund wagnerstibbe Essen

2 © eibenglaubitz 2008 Eine exakte pränatale Diagnostik setzt gegenwärtig einen invasive Eingriff voraus. CVS oder Amniocentese Abortrisiko hierdurch ca. 1% ==> alternativ: fetale Anteile in der mütterlichen Zirkulation

3 © eibenglaubitz 2008 Suche nach fetalen Zelle in der maternalen Zirkulation 4 Ansätze Trophoblastzellen fetale Leukozyten fetale Erythroblasten fetale DNA

4 © eibenglaubitz 2008 erste Hinweise auf fetale Zellen fand Trophoblastzellen in der Lunge von Patientinnen, die an Präeklampsie verstorben waren Untersuchung mittels histologischer Methoden Zellen/d 1893 durch Georg Schmorl: Schmorl, G. (1893) Pathogisch-anatomische Untersuchungen über Publeraleklampsie. Vogel, Leipzig.

5 © eibenglaubitz 2008 Trophoblastzellen in der mat. Zirkulation Trophoblastzellen wurden 1994 erstmals zur Diagnostik einer Häminoglobinopathie verwendet. Hawes et al. (1994): An N Y Acad Sci 173: Zellen werden aber in der Lunge absorbiert Plazenta weist viele Mosaike auf sind mehrkernig ==> kein Aneuploidieuntersuchung Trophoblastzellen ungeeignet

6 © eibenglaubitz 2008 fetale Lymphozyten im maternalen Blut seit Ende 1960er Jahre Untersuchung der fet. Lymphozyten Untersuchung mittels zytogenetischer Methoden Lymphos sind leichter anzureichern und zu kultivieren aber: die fetale Lymphocytenproduktion startet erst ab der ca. 20. SSW.  schlechte Ausgangssituation für eine frühe Diagnostik. aber: absolutes Überwiegen mütterlicher Leukocyten  extreme Selektionsschwierigkeiten zwischen fetalen und maternalen Zellen

7 © eibenglaubitz 2008 Untersuchungen von Bianchi et al. (1996) zeigten, dass männliche fetale T-Lymphocyten (CD 3+; CD 4+) nach 27 Jahren im Blut einer Frau gefunden wurden, die einen Jungen geboren hatte. ==> Lymphozyten sind nicht geeignet fetale Lymphozyten im maternalen Blut

8 © eibenglaubitz 2008 kernhaltige rote Blutzellen fehlen im Blut von Erwachsenen bzw. sind äußerst selten ==> bessere Detektionschance haben eine Lebensdauer von nur ca. 90 d ==> können damit nicht aus einer vorherigen Schwangerschaft stammen. Vorteile: fetale Erythroblasten im maternalen Blut Im 1. Trimenon stellen kernhaltige rote Blutzellen den größten Teil der kernhaltigen Zellen des Feten dar ==> können in die maternale Zirkulation übertragen werden

9 © eibenglaubitz 2008 fetale Erythroblasten im maternalen Blut fetale Erythroblasten : mononukleär geeignete Oberflächenantigene gesamtes fetale Genom ohne maternale Kontaminationen ==> Mögliche Diagnostik von Punktmutationen Vorliegen einer einzelnen fetalen Zelle ==> mögliche FiSH Untersuchung Vorteile:

10 © eibenglaubitz 2008 fetale Erythroblasten im maternalen Blut Untersuchung der fetalen Erythroblasten über FiSH Bianchi et al. (1992): Detection of fetal cells with 47,XY,+21 karyotype in maternal peripheral blood. Hum Genet 90: Valerio, D., Altieri, V., Cavallo, D., Aiello, R. and Antonucci, F.A. (2000) Detection of fetal trisomy 18 by short-term culture of maternal peripheral blood. Am. J. Obstet. Gynecol., 183, 222±225.

11 © eibenglaubitz 2008 fetale Erythroblasten im maternalen Blut sehr hoher methodischer Aufwand große Kontaminationsgefahr mit maternalen Zellen Allel drop out (Fehlanalyse durch „nicht Amplifikation“ einzelner Loci bei Einzelzellanalysen) Analytische Betrachtung

12 © eibenglaubitz 2008 fetale Erythroblasten im maternalen Blut 3000 klinische Fälle wurden in 5 Zentren mittels MACS oder FACS untersucht ==> fetale Zellen konnten nur mit eine Sensitivität von 50% entdeckt werden Bianchi et al. (2002), Prenat. Diagn. 22: große NIFTY Studie (National Institute of Child Health and Developement Fetal Cell Isolation Study)

13 © eibenglaubitz 2008 fetale Erythroblasten im maternalen Blut NIFTY Studie der NIH zeigte deutlich, dass die Anreicherung und Diagnostik aus zirkulierenden fetalen Zellen mit den gegenwärtigen Techniken nicht praktikabel ist! Bianchi et al. (2002), Prenat. Diagn. 22: ==> fetale DNA im maternalen Blut Lo et al. (1997): Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 12:

14 © eibenglaubitz 2008 fetale DNA im maternalen Blut Herkunft der cell free fetal DNA: Adoptosis von Trophoblastzellen Bischoff et al. (2005). Hum Repro Update 11: Cell free fetal DNA (cff DNA) ist kürzer als cell free maternal DNA (cfm DNA): 99% cff DNA < 313 bp: Hauptanteil bei

15 © eibenglaubitz 2008 fetale DNA im maternalen Blut Aneuploidiediagnostik 1) Der relative DNA Anteil eines jeden Chromosoms in der freien DNA müsste grundsätzlich gleich sein. Messung einzelner Chrom. 21 Marker und Vergleich zu Referenzmarkern anderer Chromosomen: Relative Chromosomen Dosis ROD ROD Verhältnis 2:2 = Euploid/ Verhältnis 3:2 = Aneuploid 2)Untersuchung chromosomenspezifischer Polymorphismen bei Vater & Mutter Allel Verhältnis (Allel Ratio AR) Bei euploidem Fetus Heterozygot ==> AR 1:1 bei aneuploidem Fetus ==> AR 2:1 Analysen mit hoher Sicherheit können mit nur mit multi copy Sequenzen vom Y Chromosom erfolgen!!!!!

16 ■ Schwangere, die eine Präeklampsie entwickeln, haben bereits Wochen vor Erkrankungsbeginn eine erhöhte Konzentration von fetalen Zellen und fetaler freier DNA im Blut. Zhong XY, Holzgreve W, Hahn S.: Circulatory fetal and maternal DNA in pregnancies at risk and those affected by preeclampsia. Ann N Y Acad Sci 2001; 945: 138–140. ■ 5 fach höhere cffDNA bei Schwangeren mit Präeklampsie Lo et al.: Quantitative abnormalities of fetal DNA in maternal serum in PET. Clin chem 1999; 45; ■ je höher die cffDNA Konzentration ist, desto schwerer der Krankheitsverlauf Schwinkel et al.: Hemolysis, elevated live enzymes and low platele count (HELLP) syndrome as a complication of PET...Clin Chem 2002; 48; © eibenglaubitz 2008 fetale DNA im maternalen Blut bei Präeklampsie

17 © eibenglaubitz 2008 fetale DNA im maternalen Blut Mögliche sichere diagnostische Möglichkeiten: ==> fetales Geschlecht sinnvoll? Ethisch problematisch ==> fetaler Rhesusfaktor bei rh neg. Schwangeren 17% der Deutschen sind Rhesus D negativ 0,4% unvollständige D Ausprägung

18 Deletion des Rh-D-Gens ist die häufigste Form bei Rhesus-D-negativen Europäerinnen. Aber: Mehrheit der Rh-D-negativen afrikanischen Patientinnen tragen ein Pseudogen (RHDy) oder ein (C)cde s -Allel. In beiden Allelen sind Rh-D-spezifische Sequenzen vorhanden. Aufgrund der Anwesenheit eines Stop-Codons (RHDy) oder des Ersatzes der Rh- D- spezifischen Sequenzen bei Rh-CE-spezifischen Sequenzen ([C]cde s ) keine D-Epitope auf den Erythrozyten feststellbar. ==> Sonderformen müssen mitberücksichtigt werden Molekülgrösse fetaler DNS von <300 bp zu beachten Sensitivität von >99% erforderlich © eibenglaubitz 2008 fetaler Rhesusfaktor bei Rh D neg. Schwangeren Wegen unterschiedlichen Varianten des Rh-D-Genes ist eine «Multiplex»-PCR notwendig, in welcher verschiedene Regionen des Rhesus-D-Genes amplifiziert werden.

19 © eibenglaubitz 2008 fetaler Rhesusfaktor bei Rh D neg. Schwangeren

20 © eibenglaubitz 2008 fetaler Rhesusfaktor bei Rh D neg. Schwangeren Risiko einer Alloimmunisierung bei anti-RhD Prophylaxe post Partum: ca. 1% bei anti-RhD Prophylaxe pP & pränatal: 0,3% Annahme: Rhesus Typisierung direkt nach Geburt 96,7%: anti-RhD Prophylaxe nur bei pränatalem Nachweis Rh D pos. 99,7%: anti-RhD Prophylaxe bei pränat. Nachweis Rh pos., unbestimmt & Rh. Varianten

21 © eibenglaubitz 2008 fetale DNA im maternalen Blut

22 © eibenglaubitz 2008

23 Fazit Die meisten Anwendungshoffnungen haben sich nicht erfüllt! Realisierbar sind gegenwärtig die Bestimmung Marker wie Rhesus oder y Chromosom Anteile, die bei der ggf. Mutter nicht vorhanden sind! Fetale Zellen/ DNA in der maternalen Zirkulation


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