Diagnostik, Messung, Anwendung und Interpretation

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1 Diagnostik, Messung, Anwendung und Interpretation
Serumenzyme Diagnostik, Messung, Anwendung und Interpretation

2 Enzyme - Eigenschaften
Die Bestimmung von Enzymaktivitäten in Serum, Plasma oder Harn hat für die Diagnostik und zur Verlaufs- und Therapiebeurteilung immer noch einen vorrangigen Stellenwert eingenommen. Die Menge von Enzymen im Plasma ist sehr gering, wenn man sie in Konzentrationen angibt – z.B. ALAT (GPT) 100 µg/ Liter (Gesamteiweiß g/l) Enzyme, die ihre Aufgaben im Blut haben, z.B. Cholinesterase (CHE), Gerinnungsfaktoren – kommen in höheren Konzentrationen vor. Enzyme gelangen meistens durch die Zellumsatz ins Blut.

3 Enzyme - Eigenschaften
Enzyme mit physiologischer Funktion im Blut – z.B. Thrombin, Plasmin, Cholinesterase – zeigen bei Schädigung der Ursprungszellen einen Abfall der Aktivität im Blut. Enzyme von sekretorischen (exokrinen) Drüsen – z.B. Pankreasamylase, -lipase – zeigen bei Schädigung der Ursprungszellen einen Anstieg der Aktivität im Blut. Enzyme mit physiologischer Funktion in der Zelle – z.B. LDH, GOT, GPT, CK - zeigen bei Schädigung der Ursprungszellen einen Anstieg der Aktivität im Blut.

4 Enzyme - Eigenschaften
Von der im Serum enthaltenen Aktivität eines Enzyms, das spezifisch in einem Organ synthetisiert und ins Blut sezeniert wird – z.B. CHE -, kann auf eine Schädigung des Herkunftsorgans geschlossen werden, wenn die Enzymaktivität im Blut sinkt. Von der im Serum enthaltenen Aktivität eines Enzyms, das spezifisch in einem Organ synthetisiert wird, aber nicht ins Blut abgegeben wird – z.B. CK -, kann auf eine Schädigung des Herkunftsorgans geschlossen werden, wenn die Enzymaktivität im Blut steigt.

5 Enzyme - Eigenschaften
Einige Enzyme kommen als Isoenzyme vor – das heißt, dass sie die gleiche Reaktion katalysieren. Sie kommen in verschiedenen Geweben bzw. Organen vor – z.B. Lactatdehydrogenase oder LDH, die als Tetramer in 5 verschiedenen Isoformen vorkommt. Man kann die LDH elektrophoretisch trennen, um das Herkunftsorgan herauszubekommen. LDH-1 kommt überwiegend im Herzmuskel und Erythrozyten, LDH-5 dagegen in der Leber und Skelettmuskulatur vor. Die Isoformen sind H4 (LDH-1), H3M (LDH-2), H2M2 (LDH-3), HM3 (LDH-4) und M4 (LDH-5) (H=Herz; M=Muskel)

6 Serumenzyme – Diagnostisches Nützen
Das Erscheinen bzw. Verschwinden von Enzymen im bzw. aus dem Serum kann wichtige Vorgänge im Körper widerspiegeln. Nicht nur die Geschwindigkeit des An- oder Absteigens eines Enzyms, sondern das Verhältnis von Enzymen zueinander, gibt zusätzliche Information zu einem Krankheitsverlauf bzw. zur Effizienz einer Therapie. Es gibt verschiedene Komponente der Enzymkinetik, die separat betrachtet werden müssen, um ein diagnostischen Nutzen der Ergebnisse zu optimieren.

7 Enzyme – Messung der Aktivität
Die Internationale Union für Biochemie (IUB) hat schon 1961 Empfehlungen für die optimierte Bestimmung von Enzymaktivitäten erarbeitet. Die Bedingungen für diese optimierten Methoden sind: Optimaler pH-Wert Definierte Temperatur d.h. 37 °C Optimale Substratkonzentration Optimale Coenzymkonzentration Optimale Konzentration an Aktivatoren

8 Enzyme – Messung der Aktivität
Enzymaktivität wird in Einheiten/l (U/l) angegeben. 1 internationale Einheit (U) ist diejenige Enzymaktivität, die pro Minute unter definierten Bedingungen die Umwandlung von 1 µmol Substrat katalysiert. (Dies wird für Plasma und Serum auf 1 Liter bezogen). Die Messtemperatur ist 37 °C (definierte und validierte Referenzbereiche sind oft nur für 25 °C vorhanden!)

9 Enzyme - Nomenklatur Die Enzyme Commission (EC)-Nummer beschreibt die Funktion eines Enzyms. Die ganze Liste befindet sich im „Enzyme Nomenclature“ [1972] sowie dem „Enzyme Handbook“ und seinen „Supplements“ (Springer-Verlag). Die EC-Nummer hat 4 Komponente: Stelle 1 definiert die Funktion – z.B. 1 = Oxidoreduktasen Stelle 2 definiert die Donorgruppe – z.B. 1 = CH-OH Stelle 3 definiert die Akzeptorgruppe – z.B. 1 = NAD(P) Stelle 4 ist die Enzymnummer innerhalb der Gruppe. Beispiel: EC = Alkoholdehydrogenase (NAD(P)) oder Alkohol: NAD(P) Oxidoreduktase Reaktion Alkohol + NAD(P) = Aldehyd + reduziertes NAD(P)

10 Enzyme - Nomenklatur Die Hauptgruppen von Enzymen sind:
1.x.x.x – Oxidoreduktasen (z.B. GLDH: EC , LDH: EC ) 2.x.x.x – Transferasen (z.B. Gamma-GT: EC , ASAT/GOT: EC , ALAT/GPT: EC ) 3.x.x.x – Hydrolasen (z.B. alkalische Phosphatase: EC , α-Amylase: EC , Lipase EC ) 4.x.x.x – Lyasen (z.B. Adenylatcyclase: EC ) 5.x.x.x – Isomerasen (z.B. Glucose-6-Phosphat Isomerase: EC ) 6.x.x.x – Ligasen / Synthetasen (z.B. Harnstoff-carboxylase: EC )

11 Enzyme – Messung der Aktivität
In klinisch-chemischen Vollautomaten wird alles automatisch geregelt. Die Temperierung der Messzelle findet automatisch statt. Das Gleiche gilt für das Pipettieren der Reagenzien, eventuelle Verdünnungen und Umrechnung der Ergebnisse. Es gibt verschiedene Messmöglichkeiten: kontinuierliche Verfahren (Kinetik); diskontinuierliche Verfahren (2-Punkt Messung) oder Endpunktverfahren.

12 Enzyme – Berechnung der Aktivität Berechnung des molaren Extinktionskoeffizienten - 
Die Konzentration der zumessenden Substanz in der Probe errechnet sich nach der Gleichung: c = (ΔE / [ µmol * d]) c = Konzentration der Substanz ΔE = Extinktionsdifferenz zwischen Analysen- und Leerwert bzw. Extinktionsdifferenz durch Verbrauch oder Bildung von NAD(P)H d = Schichtdicke der Kuvette in cm  µmol = spezifischer mikromolare Extinktionskoeffizient

13 Enzyme – Berechnung der Aktivität
Die Enzymaktivität entspricht der Änderung der Konzentration von Substrat oder Produkt während der Messzeit (t). Meist wird bei einer Enzymaktivitäts-bestimmung aus mehreren Messungen das durchschnittliche ΔΕ/Minute ermittelt. Von diesen Beobachtungen haben wir: Volumenaktivität = Δc / t = ΔE / (t*  µmol *d) µmol/min * ml Messlösung Δc = Änderung der Konzentration von Substrat oder Produkt t = Messzeit in Minuten

14 Enzyme – Berechnung der Aktivität
Ein Substratumsatz von 1 µmol/min = 1U. Analog zur Bestimmung von Metabolitkonzentrationen sind das Volumen der Messlösung und das Probenvolumen zu berücksichtigen. Volumenaktivität = ΔE * V/ (t*  µmol *d * v) U/ml V = Volumen der Messlösung v = Volumen, das in dem Test eingesetzten Probe Da man Ergebnisse meistens in U/l angibt, muss man mal mit dem Faktor 1000 multiplizieren. Wird verdünntes Material eingesetzt, muss dies auch berücksichtigt werden.

15 Serumenzyme - Herkunft
Sekretionsenzyme – Cholinesterasen Reaktion: Acylcholin + H2O  Cholin + R.COOH Es gibt zwei Gruppen von Cholinesterasen: die wahre Acetyl(thio)cholinesterase (AChE) (2 Typen bekannt) und die Pseudocholinesterasen (CHE) (Serumcholinesterasen, ca. 18 Typen bekannt), die neben Acetylcholin auch Butyrylcholin und andere Acylcholine sowie Thiocholine spalten. Die Bestimmung von AChE hat – im Gegensatz zur CHE– so gut wie keine klinische Bedeutung. Die CHE biologische Halbwertzeit im Serum beträgt ca. 10 Tage.

16 Cholinesterase – diagnostisches Nutzen
Aktivitätsänderungen bei der Cholinesterase: Erhöhung bei: Proteinverlustsyndrom (nephrotisches Syndrom), unkomplizierte Fettleber (Frühform der alkoholischen Leberschädigung), funktionelle Hyperbilirubinämie, Hypertriglyceridämie, Adipositas, Diabetes mellitus. Erniedrigung bei: chronischer Hepatitis, Leberzirrhose, Kwashiokor, ChE-Inhibitoren [ Physostigmin, Cyclophosphamid ], Schwangerschaft (2. Trimenon bis 6 Wochen post partum), Verschiedenes ( Septikämie, Verbrennungen, postoperativ, Antikontrazeptiva, Malignome, Anämien)

17 Weitere Serumenzyme – Beispiele und diagnostische Anwendung in der Gerinnung
Andere Enzyme mit Aktivität im Plasma sind die, die mit der Blutgerinnung zu tun haben. Hierzu gehören u.a. Urokinase, Gewebetyp Plasminogenaktivator (t-PA) und Thrombin sowie die überwiegende Zahl der Gerinnungsfaktoren, die je in einer inaktiven Form vorliegen, die während des Gerinnungsprozesses stufenweise aktiviert werden. Normalerweise werden die Enzyme selber nicht gemessen, sondern ihre biologische Aktivität im Form von „globalen“ Tests, wie der Quick-Wert [auch Thromboplastinzeit, TPZ oder Prothrombinzeit genannt]. Hier werden eine Verminderung der Faktoren II, V, VII, X sowie Vitamin-K und Fibrinogen erfasst. Der Quick-Wert wird u.a. zur Kontrolle einer Cumarin-Derivat Antikoagulantientherapie angewendet. Die Werte werden normalerweise als Prozent eines Normal-Poolplasmas angegeben (Normal: %).

18 Serumenzyme – als Globalteste in der Gerinnung
Andere Globalteste (mit ähnlichen Abkürzungen!) sind: Partielle Thromboplastinzeit [PTT] und aktivierte partielle Thromboplastinzeit [aPTT] – Prüft die Faktoren XII, XI und IX sowie die gemeinsame Endstrecke der Gerinnung (Faktoren X, VIII, II, V und I). Mit der aPTT erfasst man auch Prokallikrein und HMW-Kininogen durch den Zusatz von Oberflächenaktivatoren, wie Kaolin. Plasma Thrombinzeit [PTZ] – Die PTZ wird eingesetzt, um ein Fibrinogenmangel zu prüfen.

19 Enzyme – Messung der Aktivität Kinetisch-Optischer Test - IFCC Methode
Die Bestimmung der LDH-Aktivität im Serum. Reaktion: Lactat + NAD+  Pyruvat + NADH + H+ Messprinzip: Die Zunahme der Extinktion durch das Entstehen des Coenzyms NADH bei 339 nm im Spektralphotometer. Als Substrat dient Lactat. Im Prinzip kann man die Reaktion in die entgegengesetzten Richtung steuern. Man muss dann Pyruvat im Überschuss haben und einen anderen pH-Wert einstellen. NAD+ - Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid - oxidierte Form NADH – NAD reduzierte Form

20 Enzyme – Messung der Aktivität Zusammengesetzter optischer Test mit Indikatorreaktion
Die Bestimmung des ASAT (GOT) im Serum ASAT – Aspartat-Amino-Transferase GOT – Glutamat-Oxalacetat-Transaminase Reaktion: Enzym ASAT/GOT L-Aspartat + α-Oxoglutarat  L-Glutamat + Oxalacetat Indikatorreaktion: Enzym/Malatdehydrogenase Oxalacetat + NADH + H+  Malat – NAD+ Messprinzip – Abnahme der Extinktion bei 334 nm (Oxydation des NADH)

21 Enzyme – Messung der Aktivität Zusammengesetzter optischer Test mit Hilfs- und Indikatorreaktion
Bestimmung der Creatinkinase (CK) im Serum: Reaktion: Enzym Creatinkinase Creatinphosphat + ADP  Creatin + ATP Hilfsreaktion: Enzym Hexokinase ATP + D-Glucose  ADP + D-Glucose-6-Phosphat Indikatorreaktion: Enzym G-6-P-dehydrogenase G-6-P + NADP+  6-Phosphogluconat + NADPH + H+ Messprinzip: Messung der Extinktionszunahme bei 334 nm (Reduktion des NADP zu NADPH)

22 IFCC Methode – Creatin Kinase
Messbedingungen für die CK Temperatur: 37,0 °C ± 0,1 °C Wellenlänge: 339 nm ± 1 nm Bandbreite:  2 nm Lichtweg (in der Kuvette): 10,00 mm ± 0,01 mm Inkubationszeit: 180 s Verzögerungszeit: 120 s Messinterval: 120 s Anzahl der Messpunkte: mindestens 6

23 Enzyme – Messung der Aktivität Verfahren zur Messung im Bereich des sichtbaren Lichtes
Bestimmung der alkalischen Phosphatase im Serum: Reaktion: p-Nitrophenylphosphat (pNPP)  pNP + PO4 pNPP ist farblos; pNP dagegen gelb bei pH 10 Messprinzip: AP katalysiert die Hydrolyse von pNPP bei pH 9,8 unter Zunahme der Farbe (Extinktion) bei 405 nm) Kontinuierliche (kinetische) Messung Als Cofaktoren werden Mg+2 und Ca+2 benötigt EDTA- bzw. Citratplasma können, wegen ihrer komplexierenden Eigenschaften nicht als Probe benutzt werden.

24 Enzyme - Diagnostik GPT / ALAT
Wird zur Lebererkrankungs-Diagnostik eingesetzt GPT ist überwiegend im Zytoplasma der Leberparenchymzellen zu finden. Wichtigster Leberzellnekroseparameter in kleinen Mengen auch in der Niere, Herz- und Skelettmuskulatur Störungen – Stark lipämische Seren können nicht analysiert werden. Referenzbereiche: (37 °C) – m: <41; f: <31 U/l

25 Enzyme - Diagnostik GOT / ASAT
Wird zur Lebererkrankungs-Diagnostik eingesetzt GOT ist überwiegend in der Leber sowie im Herz- und Skelettmuskulatur zu finden in kleinen Mengen auch im Gehirn Wichtiger Leberzellnekroseparameter, in Verbindung mit der GPT Hinweis auf die Schwere der Leberzellschädigung. Erhöhte Werte: akuter und chronischer Hepatitis, Leberzirrhose, Fettleber, aber auch Herzinfarkt und Muskeldystrophie. Störungen – Stark lipämische Seren können nicht analysiert werden. Referenzbereiche: (37 °C) – m: <38; f: <32 U/l

26 Enzyme - Diagnostik Laktatdehydrogenase - LDH
LDH kommt in allen Geweben vor, wobei sich die höchste Aktivität in Skelettmuskulatur, Herzmuskel, Niere, Gehirn und Leber findet Aufgrund der fehlenden Organspezifität eignet sich die Gesamt-LDH allein nur wenig als diagnostischer Parameter. LDH-1 als „Spätindikator“ für einen Herzinfarkt LDH erhöht bei: hämolytische Anämien, Lungenembolie Skelettmuskelerkrankungen Leber und Gallenwegserkrankungen (LDH-5): akute Hepatitis, akute Parenchymzellschädigung durch Intoxicationen Störungen – Hämolytische Seren können nicht analysiert werden. IFCC Referenzmethode (37 °C) - m: <225; f: <215 U/l

27 Enzyme - Diagnostik Glutamatdehydrogenase - GLDH
Wird zur Leber-Diagnostik eingesetzt, da GLDH ausschließlich intramitochondrial in Leber vorkommt. Ein starker Anstieg der GLDH weist immer auf eine schwere Leberschädigung hin, insbesondere der zentroazinären Abschnitte, z.B. bei akuter Stauungsleber. Reaktion: α-Oxoglutarat + NADH + NH4  L-Glutamat + NAD+ + H2O Referenzbereiche: (37 °C) – m: <6,4; f: <3,8 U/l

28 Enzyme - Diagnostik Gamma-Glutamyltransferase – γGT
γGT findet sich in der Leber überwiegend in den kanalikulären Segmenten der Hepatozytenmembran und in den Epithelien der intrahepatischen Gallenwege. γGT ist ein Leberzellnekrose- und Cholestaseparameter Reaktion: γ-Glutamyl-p-Nitroanilid (farblos) + Glycylglycin  γ-Glutamyl-Glycylglycid + p-Nitroanilin (gelb) (405 nm) Referenzbereiche: (37 °C) – m: <49; f: <32 U/l

29 Enzyme - Diagnostik Alkalische Phosphatase - AP
Cholestaseparameter und Knochenerkrankungen mit erhöhter Osteoblastenaktivität Isoenzyme: Leber-AP, Knochen-AP und Nieren-AP. Die Aktivität im Normalserum ist hauptsächlich auf das Leber- und Knochenisoenzym zurückzuführen. Störungen – nur Serum bzw. Heparinplasma, nicht Citrat und EDTA verwenden. Referenzbereiche: (37 °C) – m: <270; f: <240 U/l. Kinder in Wachstumsalter haben höhere Werte (Knochenbau)

30 Enzyme - Diagnostik Bei Cholestase steigen AP und -GT im Serum an.
erhöhte gesamt AP kommt auch bei andere Erkrankungen vor: Osteopathie mit erhöhter Osteoblastenaktivität, Nierenerkrankungen, Rachitis, Schwangerschaft (letztes Trimenon), maligne Tumoren. -GT Erhöhungen im Serum sind bei etwa 95% aller Fälle durch eine hepatobiliären Erkrankung zustande gekommen. -GT ist ein guter Marker für Alkoholabusus Mäßig erhöhte -GT kommt bei einer chronisch aktiven Hepatitis, primär biliäre Zirrhose und chronische Pankreatitis vor.

31 Bedeutung von Quotientenbildung
De-Ritis Quotient = GOT/GPT - akute Virushepatitis: < 0,7 unkompliziert, >0,7 nekrotisierend - chronische Hepatitis, Leberzirrhose: ca.1 - nicht hepatisch (Trauma/Herzinfarkt): >1 Quotient (GOT+GPT)/GLDH gilt als Maßstab für den Schweregrad der Hepatozytenschädigung. - < 20 bei schwerer Schädigung – 50 bei mäßiger Schädigung

32 Bedeutung von Quotientenbildung
Beispiele von Quotienten bei einer Hepatitis-A Typischer ikterischer Verlauf / cholestatischer Verlauf Wochen 1 3 5 7 AST/ALT 25 °C 37 °C 0,54 / 0,49 0,28 / 0,28 0,31 / 0,36 0,65 / 0,31 0,66 / 0,31 (AST +ALT)/ GLDH 116 / 93 174 / 140 107 / 109 160 / 164 49 / 200 74 / 300 38 / 88 57 / 132

33 Enzyme - Diagnostik Creatinkinase - CK
CK kommt in hoher Aktivität in der Skelettmuskulatur, im Herzmuskel und im Gehirn 3 Isoenzyme: CK-MB (Myokardtyp), CK-MM (Muskeltyp) und CK-BB (Gehirntyp) Skelettmuskelerkrankungen: Rhabdomyolyse, Myositis, progressive Muskeldystrophie, Polytrauma, Muskeltrauma (inkl. i.m. Injektionen) Herzmuskelerkrankungen: akuter Myokardinfarkt (Diagnostik und Verlaufskontrolle), Kontrolle einer Thrombolysetherapie, Myokarditis Referenzbereiche: (37 °C) – m: <170; f: <145 U/l

34 Enzyme - Diagnostik beim Herzinfarkt
CK-MB erreicht im Myokard ihre höchste Konzentration Obwohl CK-MB nicht vollständig kardiospezifisch ist, wird sie in Verbindung mit der Gesamt-CK neben den kardialen Troponinen weiterhin als biochemischer Marker für den akuten Herzinfarkt eingesetzt. Cardiac-Troponin-T - Methode der Wahl, da standardisiert Cardiac-Troponin-I Troponin-C ist nicht spezifisch genug für die Herzinfarktdiagnostik. CK,CK-MB und Troponin T steigen 2-6 h nach einem Infarkt. Myoglobin nach 1-2 h; GOT nach 4-6 h; LDH-1 (HBDH) nach 6-12 h;

35 Serumenzyme – Referenzbereiche für gesunde Erwachsene – 37 °C
-GT – M: < 50 U/l; F: < 32 U/L (IFCC) AP – M: U/l; F: U/L GPT – M: < 40 U/L; F: < 33 U/L (IFCC mit P-5-P) GOT – M: < 43 U/L; F: < 36 U/L (IFCC mit P-5-P) CK – M: U/L; F: U/L (IFCC) CK-MB – M: < 18 U/L; F: < 18 U/L GLDH – M: < 6,7 U/L; F: < 4,8 U/L LDH – M: U/L; F: U/L (IFCC) LDH-1 (HBDH) – M: < 171 U/L; F: < 202 U/L (Wood et al.: Clin Lab 2004; 50: )