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Biosensors and Biofuel cells with engineered proteins Seminar Biotechnologie 2 Lisa Marie Finkler WS 2012/13 Betreuer: Prof. Dr. Kohring 1.

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1 Biosensors and Biofuel cells with engineered proteins Seminar Biotechnologie 2 Lisa Marie Finkler WS 2012/13 Betreuer: Prof. Dr. Kohring 1

2 Gliederung Aufbau einer Biokraftstoffzelle Aufbau eines Biosensors Detektionsprinzipien von Sensoren ▫Piezoelektrisch ▫Optisch ▫Kalorimetrisch ▫Elektrochemisch Anwendungsbereiche 2

3 Gliederung Erkennungsprinzipien von Biosensoren ▫Enzymbasiert ▫Antikörperbasiert ▫Zellbasiert ▫DNA-basiert ▫Rezeptorbasiert Vergleich von Biosensoren und Biokraftstoffzellen (Selektivität, Sensitivität, Stabilität) Verbesserungsansätze der Betriebsparameter 3

4 Aufbau einer Biokraftstoffzelle 4 [8]

5 Aufbau einer Biokraftstoffzelle Mediator-basierte Mediatorlose mikrobielle Brennstoffzelle Redoxmediatoren  Transport von Elektronen z.B.: Methylenblau, Thionin, Neutralrot Enzymatische Brennstoffzellen ▫Hohe Spezifizität ▫Keine Trennung der Kompartimente notwendig ▫Miniaturisierung möglich Mikrobielle Brennstoffzellen ▫Breiteres Substratspektrum ▫Enzyme in natürlicher Umgebung 5

6 Aufbau eines Biosensors 6 [12]

7 Detektionsprinzipien von Sensoren Umwandler Piezo- elektrische Sensoren Optische Detektion Kalorimetrie Elektro- chemische Sensoren 7

8 Piezoelektrische Sensoren Die Schwingungsfrequenz eines Quarzes ist umgekehrt proportional zur Wurzel seiner Masse f≈√( 1/m) Quarzkristall mit Rezeptorschicht  Mikrowaage Resonanzschwingung nach Anregung des Quarzes Bindung von Substanzen  Veränderung der Schwingung 8

9 Optische Sensoren Bestimmung des O2-Gehaltes von Gewässers Optode: Lichtwellenleiter mit Indikator Bindung des Analytes  Veränderung der Absorptions- oder Lumineszenzeigenschaften 9 [16]

10 Optische Sensoren - SPR Evaneszenz: ▫tritt bei der Totalreflexion an optisch dichterem zu optisch dünnerem Lichtleiter auf ▫Reflexion nicht direkt an der Grenzfläche ▫Teil des Lichtes durchdringt die Grenzfläche 10 [13]

11 Kalorimetrische Sensoren Reaktion  Wärmefreisetzung Temperaturerhöhung  abhängig von der Stoffmenge der Reaktionspartner Bsp.: Umsetzung von Glucose durch Glucoseoxidase 11 [14]

12 Elektrochemische Sensoren Amperometrische Sensoren  Messung des Stromflusses in einer Messkammer an zwei Elektroden bei konstanter Spannung  Änderung des Stromflusses bei Ausbildung eines Analyt- Rezeptor-Komplexes  geeignet für leicht oxidierbare, reduzierbare Substanzen Potentiometrische Sensoren  quantitave Bestimmung der Ionen aufgrund ihres elektrischen Potentials (Messelektrode)  Änderung der Spannung bei Ausbildung eines Analyt- Rezeptor-Komplexes  geeignet für ionische Reaktionsprodukte 12

13 Elektrochemische Sensoren 13 [17]

14 Anwendungsbereiche MedizinStoffwechselprodukte (Blutzucker, Cholesterin, Harnstoff) UmweltanalytikPestizide, Chemikalien Bakteriengehalt SicherheitskontrolleGifte, Drogen LebensmittelkontrollepH-Wert, Toxine, Schimmel Aromastoffe 14

15 Erkennungsprinzipien von Biosensoren 15 [9]

16 Enzymbasierte Biosensoren Historisch die ersten Biosensoren Optimierung durch genetische Veränderung (Enzymaktivität, Substratspezifizität) Innovationen im Bereich der Immobilisierung (Sol-Gele, Redox-Mediatoren) Inhibition durch Schadstoffe (toxische Metalle: Cu(II), Hg(II), Cd(II), Zn(II)) Problem der Spezifizität zur Detektion von Schadstoffen innerhalb einer Klasse

17 Antikörperbasierte Biosensoren Immunosensoren binden Substanzen spezifisch Nicht geeignet für komplexe Proben  Verschiedene Ansätze  Mikrochips (immobilisierte Antikörper)  River Analyzer (Bindungshemmtest) 17 [15]

18 Zellbasierte Biosensoren Gliederung nach Zelltyp (Bakterien, Hefen, Algen)  GEMs (genetically engineered bacteria)  Detektion der Substanzen durch regulatorische System  Substanzen: DNA-schädigende Substanzen, Strahlung, Hitze, toxische Metalle, Umweltgifte  Vorteil: selbstständige Produktion von Enzymen, Kofaktoren; selbstreplizierend; Transducervariabilität  Nachteil: abhängig von vielen Umweltfaktoren; Zeit (Signal); begrenzter Konzentrationsbereich 18

19 DNA-basierte Biosensoren Einsatz: ▫Medizinische Diagnostik ▫Umweltanalytik ▫Lebensmittelindustrie  DNA-schädigende Chemikalien  fluoreszenzbasierte Biosensoren  DNA-Microarray Rezeptorbasierte Biosensoren Vorteil: ▫Detektion jeglicher Substanzen in relevanten Konzentrationen  Endokrin wirksame Substanzen (chemische, natürliche Verbindungen)  Bsp.: humane Östrogen- rezeptor Alpha 19

20 Vergleich von Biosensoren und Biokraftstoffzellen (Selektivität, Sensitivität, Stabilität) Funktion von Proteinen: Spezifische Erkennung der Analytmoleküle Signalweiterleitung 20 [10]

21 Biokraftstoffzelle Anode: Elektronenquelle  Oxidation von Glucose (Glucoseoxidase) Kathode: Elektronensenke  Reduktion von O2 (Lactase)  2 Enzyme: keine Kreuzreaktion 21 [10]

22 Vergleich von Biosensoren (1) und Biokraftstoffzellen (2) 1) hochspezifisch 2) Breites Substratspektrum Selektivität 1) Lineare Antwort über den Konzentrationsbereich 2) Höchste Umsatzrate Sensitivität 1) Lagerfähigkeit 2) Stromgenerierung Stabilität 22

23 Verbesserungsansätze der Betriebsparameter von Biosensoren Selektivität: „Protein Engineering“ Bsp.: Acetylcholinesterase  Nachweis von Dichlorvos (Insektizid, umweltgefährdend)  Inhibition: Senkung der katalytischen Aktivität  Bestimmung der Konzentration über Aktivitätsänderung Optimierung der Immobilisierung Bsp.: Bindung eines viralen Rezeptors über C-terminale Hexahistidin tag auf Goldoberfläche Bsp.: Verknüpfung über langen terminalen Peptidlinker  Flexibilität; keine Denaturierung 23

24 Verbesserungsansätze der Betriebsparameter von Biokraftstoffzellen Enges Substratspektrum bei biomedizinischen Biokraftstoffzellen (Glukose) Breites Substratspektrum zur Energieerzeugung ▫„Protein Engineering“ ▫„nativen Multi-Enzym-Kaskade“ Bsp.: Abbau von oligomerer Lignocellulose  Verringerung der strukturellen Komplexität  Verwertung als Substrat für Biokraftstoffzelle 24

25 Quellen [1] ( )http://www.aktuelle-wochenschau.de/2006/woche45b/woche45b.html [2] ( )http://en.wikipedia.org/wiki/Microbial_fuel_cell [3] Instrumentelle Analytik und Bioanalytik, Manfred H. Gey; Springer (2008) [4] Bioanalytische Und Biochemische Labormethoden; Kurt E. Geckeler,Heiner Eckstein; Vieweg [5] Sensoren in Wissenschaft und Technik: Funktionsweise und Einsatzgebiete, Ekbert Hering,Gert Schönfelder; Vieweg + Teubnder (2012) [6] Biofuel Cells for Self-Powered Electrochemical Biosensing and Logic Biosensing: A Review; Ming Zhou, Joseph Wang; Electroanalysis (2012), 24, No. 2, [7] Biosensor Applications in the Field of Antibiotic Research- A Review of Recent Developments; Katrin Reder-Christ, Gerd Bendas; Sensors (2011), 11,

26 Quellen [8] [9] Recent advances in biosensor techniques for environmental monitoring; K.R.Rogers; Analytica Chimica Acta 568 (2006) [10] Biosensors and biofuel cells with engineered proteins; Daren J. Caruana, Stefan Howorka; Molecular BioSystems (2010), 6, [11] quantitive-analytik-lebensmittel-und-wasseranalytik-milch ( )http://www.git-labor.de/news/aus-der-wissenschaft/biosensoren-fuer- quantitive-analytik-lebensmittel-und-wasseranalytik-milch [12] [13] [14] [15] quantitive-analytik-lebensmittel-und-wasseranalytik-milchhttp://www.git-labor.de/news/aus-der-wissenschaft/biosensoren-fuer- quantitive-analytik-lebensmittel-und-wasseranalytik-milch [16] daten.didaktikchemie.uni-bayreuth.de [17] 26


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