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Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000.

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Präsentation zum Thema: "Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000."—  Präsentation transkript:

1 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Diplomarbeit Sören Werner Betreuer:Prof. Dr. rer. nat. habil. Th. Bley Prof. Dr.-Ing. D. Eibl Dr. rer. nat. D. Grimmecke

2 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Folie 2 Dresden Sören Werner EinleitungTheorie Material und Methoden ErgebnisseFazit Escherichia coli Wildstamm mit weitestgehend unbekannter Physiologie Bisher identifizierte Eigenschaften liefern Anhaltspunkte für eine mögliche probiotische Nutzung zur Prävention und Akutbehandlung entzündlicher Darmerkrankungen Gestiegene Anzahl antibiotikaresistenter Krankheitserreger stärkt das Marktpotential probiotischer Pharmakons in Human- und Veterinärmedizin Zusätzlich sind Nebenwirkungen von Antibiotika unerwünscht Ziel Kultivierung des Stammes mit einer hohen Zelldichte und einer Anpassung an das Milieu Verdauungstrakt 1Einleitung

3 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Folie 3 Dresden Sören Werner EinleitungTheorie Material und Methoden ErgebnisseFazit Escherischia coli Fakultativ anaerobes, gramnegatives, stäbchenförmiges, nichtsporenbildendes und peritrisch begeißeltes Bakterium aus der Familie der Enterobacteriaceae Medizinische Mikrobiologie unterscheidet kommensale, nichtpathogene und pathogene Stämme Diagnostische Differenzierung beruht auf der serologischen Einteilung von Kauffmann nach O-, H- und K-Antigen 2Theoretischer Überblick

4 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Folie 4 Dresden Sören Werner EinleitungTheorie Material und Methoden ErgebnisseFazit Wachstum von E. coli Heterotrophe Mikroorganismen Energie aus Oxidation energiereicher organischer Verbindungen Bei E. coli Kohlenhydrate, organische Säuren oder Aminosäuren als Energie- und Kohlenstoffquelle Ammoniumverbindungen oder Aminosäuren als Stickstoffquelle Makroelemente wie Magnesium, Kalium, Eisen und Phosphor essentiell Mikroelemente wie Bor, Mangan, Kupfer, Cobalt, Molybdän in spezifischen Funktionen 2Theoretischer Überblick

5 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Folie 5 Dresden Sören Werner EinleitungTheorie Material und Methoden ErgebnisseFazit Stressantwort von E. coli Allgemeine Stressantwort geregelt durch alternativen -Faktor Sveränderte RNA-Synthese Säurestressantwort durch Bildung biogener Amine aus korrespondierenden Aminosäurendadurch Verbrauch eines Wasserstoffions Aminosäure/Amin-Paare: Glutaminsäure/ -Aminobuttersäure (GABA), Arginin/Agmatin/Putrescin, Ornithin/Putrescin und Lysin/Cadaverin 2Theoretischer Überblick

6 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Folie 6 Dresden Sören Werner EinleitungTheorie Material und Methoden ErgebnisseFazit Kultivierungen Komplexes Nährmedium (Pepton) anaerob in Schüttelkultur (37 °C, 150 rpm, pH-ungeregelt) Komplexes Nährmedium (Pepton, LB) aerob im 15L Bioreaktor von Braun (37 °C, rpm, 1-2 vvm, pH 6,8) Wachstum, Substratverbrauch und Produktbildung aufgezeichnet Bildung biogener Amine als Zeichen der Stressadaption durch HPLC- Analyse ermitteltPhysiologie in Bezug auf Stressantwort und Wachstum Nach Medienoptimierung Validierung des Mineralmediums durch Versuche in Analogie zu Komplexmedium 3Material und Methoden

7 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Folie 7 Dresden Sören Werner EinleitungTheorie Material und Methoden ErgebnisseFazit Medienoptimierung Ableitung chemisch definiertes Mineralmedium aus Erkenntnissen von Wachstumsversuchen und Literaturangaben Optimierung in einem Mikrotiterplattenphotometer (Thermo Electron) Mineralmedium aus Glucose, Ammoniumchlorid, Phosphatpuffer, Magnesiumsulfat und Spurenelementen 3Material und Methoden

8 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Folie 8 Dresden Sören Werner EinleitungTheorie Material und Methoden ErgebnisseFazit Analysen Zellzahl und Biotrockenmassekonzentration über Korrelation zur optischen Dichte ermittelt Medienbestandteile mit Bioprofile 300 (Nova Biomedical) untersucht Konzentration biogener Amine und korrespondierender Aminosäuren mittels HPLC (Dionex) bestimmt 3Material und Methoden

9 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Folie 9 Dresden Sören Werner EinleitungTheorie Material und Methoden ErgebnisseFazit Komplexmedium anaerob Wachstum bis zu einer Zelldichte von 0,35 g·L -1 pH-Wert sinkt auf 4,0 Glucoseverbrauch von insgesamt 2,5 g·L -1 (teils auch nach Wachstumsstop) Metabolismusaktivität Acetat- und Ethanolausschüttung (1,3 g·L -1 bzw. 0,35 g·L -1 ) auch nach Wachstumsstop Aminausschüttung equimolar und zeitgleich zu Aufnahme von Aminosäuren als Zeichen der Säurestressantwort 4Ergebnisse

10 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Folie 10 Dresden Sören Werner EinleitungTheorie Material und Methoden ErgebnisseFazit Komplexmedium aerob Wachstum bis zu einer Zelldichte von 2,5 g·L -1 pH-Wert geregelt (pH 6,8) Hohe Acetatausschüttung (1,3 g·L -1 ) trotz ausreichender Sauerstoffsättigung aufgrund hoher Glucosekonzentration (36 g·L -1 ) Ausschüttung von Cadaverin und Putrescin trotz physiologischem pH-Wert Keine Bildung von -Aminobuttersäure und Agmatin 4Ergebnisse

11 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Folie 11 Dresden Sören Werner EinleitungTheorie Material und Methoden ErgebnisseFazit Medienentwicklung und -optimierung pH-Wert ungeregelt optimales Wachstum bei Glucosekonzentration von 7,2 g·L -1 Ammoniumchlorid als bevorzugte Stickstoffquelle Aminosäuren mit teils negativen Auswirkungen Zugabe von Vitaminen nahezu ohne Einfluss auf Wachstum 4Ergebnisse

12 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Folie 12 Dresden Sören Werner EinleitungTheorie Material und Methoden ErgebnisseFazit Mineralmedium anaerob Wachstum bis zu einer Zelldichte von ca. 0,15 g·L -1 pH-Wert sinkt auf 4,0 Keine Stressantwort in Form von biogenen Aminen nachweisbar unbekannte Cofaktoren müssen analysiert werden 4Ergebnisse

13 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Folie 13 Dresden Sören Werner EinleitungTheorie Material und Methoden ErgebnisseFazit 4Ergebnisse Mineralmedium aerob Wachstum bis zu einer Zelldichte von 5 g·L -1 pH-Wert geregelt (pH 6,8) Kaum Acetatausschüttung Vollständiger Verbrauch von Glucose (7,2 g·L -1 ) Parameter: µ max =0,79 h -1, Y X/Gluc =0,76 g·g -1, K Gluc =0,003 g·L -1, Y X/NH4 + =0,13 g·mmol -1

14 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Folie 14 Dresden Sören Werner EinleitungTheorie Material und Methoden ErgebnisseFazit Aerobe fed-batch-Strategie Wachstum bis zu einer Zelldichte von 60 g·L -1 pH-Wert geregelt (pH 6,8) Acetatausschüttung bei Limitierung durch Sulfatmangel (Stunde 18) Ausschüttung von Cadaverin, Putrescin und -Aminobuttersäure trotz physiologischem pH-Wert teilweise konstitutive Bildung Weitere Parameter: Y X/PO 4 3+ =3,55 g·mmol -1, Y X/SO 4 2+ =14 g·mmol -1 4Ergebnisse

15 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Folie 15 Dresden Sören Werner EinleitungTheorie Material und Methoden ErgebnisseFazit 5Fazit Zusammenfassung Ausgeprägte Stressantwort durch Biosynthese biogener Amine im Komplexmedium unter anaeroben, nicht pH-geregelten Bedingungen Aufnahme von Aminosäure und Export der korrespondierenden Amine nahezu equimolar und zeitgleich Unter aeroben, pH-konstanten Bedingungen keine Beziehung Medienoptimierung im Mikrotiterplattenphotometer ist ressourcenschonend Optimale Glucosekonzentration 7,2 g·L -1 Mineralmedium mit gutem aerobem Wachstum Säurestressantwort auch bei Zugabe der benötigten Precursoren kaum vorhanden Bei höheren Zelldichten (fed-batch bis 60 g·L -1 ) unter pH-konstanten Bedingungen Bildung von Aminenteils konstitutiver Charakter

16 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Folie 16 Dresden Sören Werner EinleitungTheorie Material und Methoden ErgebnisseFazit Ausblick Säurestressantwort im Mineralmedium Assay zur Bestimmung der allgemeinen Stressantwort ( s ) Vitalitätsbestimmung Verbesserte Prozessführung mit online-Messung 5Fazit

17 Institut für Lebensmittel- und Bioverfahrenstechnik Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Folie 17 Dresden Sören Werner EinleitungTheorie Material und Methoden ErgebnisseFazit Danke für Ihre Aufmerksamkeit Offene Fragen?


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