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Übungen zu Ökologischen Fragen in der Lebensmittelproduktion mit mikrobiellen Gemeinschaften Haslberger, Handschur.

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Präsentation zum Thema: "Übungen zu Ökologischen Fragen in der Lebensmittelproduktion mit mikrobiellen Gemeinschaften Haslberger, Handschur."—  Präsentation transkript:

1 Übungen zu Ökologischen Fragen in der Lebensmittelproduktion mit mikrobiellen Gemeinschaften Haslberger, Handschur

2 Übungsablauf MO: Vortrag Methoden, DNA-Extraktion u. DNA-Reinigung DI: 1st PCR, nested PCR, Agarosegel, Vorbereitung des DGGE-Gels, DNA-Fällung MI: DGGE, Interprätation der Ergebnisse DO: Extraktion bakterieller DNA aus Blut mittels neuer Extraktionsmethode, DNA-Messung mit UV, PCR (Hanusch Spital)

3 Inhalt Culture dependent vs. Culture independent Methods PCR RT-PCR DGGE, TGGE SSCP, MSSCP RFLP, TRFLP RISA, ARISA Cloning, Sequencing

4 2 ways for identification: +/- cultivation Sample Identification of Microorganisms DNA/RNA Culture- independent Methods Culture Culture- dependent Methods

5 Only 1-5% of bacteria can be identified in ecosystems using methods including cultivation HabitatCultivability (%) Freshwater0,25 Brackish water0,1-3 Sedimente0,25 Soil0,3 Food general0,5-10

6 Culturable Wachstumsbedingungen bekannt –Temperatur, Nährstoffe, aerob/anaerob Keim lebend Verschiebung der Flora 99% aller Bakterien unbekannt

7 Culture independent

8 Spezies Sequenz S. aureus CGAA CGG ACG AGA AGC TTG CTT CTC T GAT S. epidermidis CGAA CAG ACG AGG AGC TTG CTC CTC T GAC S. capitis CGAA CAG ACG AGG AGC TTG CTC CTC T GAC S. warneri CGAA CAG ATA AGG AGC TTG CTC CTT T GAC S. haemolyticus CGAA CAG ATA AGG AGC TTG CTC CTT T GAC

9 Polymerase Chain Reaction

10 Realtime-PCR

11 RT-PCR Fluorescence (F1) Cycle Number 10 6 cop 10 5 cop 10 4 cop 10 3 cop

12 RT-PCR

13 Denaturant Gradient Gel Electrophoresis

14

15 Temperature Gradient Gel Electrophoresis Prinzip wie DGGE Keine DNA- denaturierende Substanzen Temperatur Gradient

16 Singlestrand Conformatiom Polymorphism DNA denaturierende Substanzen der Probe zugesetzt ssDNA Unterschiedliche Konformation der ssDNA beeinflusst Laufgeschwindigkeit im Gel

17 SSCP

18 Multitemperature Singlestrand Comformation Polymorphism ssDNA Denaturants added to PCR- product Different bands because of different conformation of ssDNA Temperature is changing during the electrophoresis Using high voltage

19 MSSCP

20 Temperatur changing during run Temp. 34°C 22°C 10°C 5´ 2´ Zeit

21 MSSCP SSCP bei untersch. Temp.SSCP m. wechselnder Temp.= MSSCP

22 MSSCP

23 (Terminal) Restriction Fragment Length Polymorphism

24 Cutting enzymes HIND IIIA/AGCTT BAM HITGG/CCA Eco RIGT/AATTC 1) -AGTTGG CCAAGCTTTGCTTAGGC 2) -AGGTCCTGATGA AGCTTGGTTAT 3 ) -TTTGG CCATTA AGCTT AGT AATTC 1)2)3)1) + 2) + 3)

25 (Automated) Ribosomal Intergenic Spacer Analysis dsDNA between 16 S and 23 S rRNA-Gene (Intergenic Spacer) Fluorescently primers Different bands because of different length of PCR- product

26 Sensitivity DGGE: % bp SSCP: % bp MSSCP: % bp [T]RFLP: 90 – 100% bp [A]RISA: % bp

27 Membran Hybridisierungsverfahren Target DNA Northern Blot: Mit DNA-/RNA-Sonden wird RNA nachgewiesen Southern Blot: Mit DNA-/RNA-Sonden wird DNA nachgewiesen Y Western Blot: Mit markiertem Antibody wird Protein nachgewiesen

28 Methode DNA extractionPCRDGGE Food samples Comparison of bandpatterns Monitoring Community fingerprints Clone libraries Screenig for different clones and sequencing Identification of microorganisms

29 PCR 1. Runde PCR (lange Fragmente) 600 –1300 bp Nested PCR Einer der Primer trägt am 5-Ende eine GC-clamp. 200 – 500 bp Amplifikation der 16S rDNA Klonierung DGGE

30 Agarosegel

31 DGGE

32 Cloning BHI-Agar + Tet + Amp + IPTG + X-Gal ~ 700 bp Extrahierte DNA PCR Amplifikation der langen Fragmente Ligation

33 Cloning Lac Z Lactose --> Galactose + Glc X-Gal --> blau (Kolonien blau) klonierte DNA Lactose X-Gal (Kolonien weiß) ß-Galactosidase

34 Blue/white screening

35 Clone screening

36 Sequenzierung

37

38 FASTA run Alignment DB:ID Source Length Identity% Ungapped% EM_PRO:AB Enterococcus faecalis gene e EM_PRO:AB Enterococcus faecalis gene e EM_PRO:AB Enterococcus faecalis gene e EM_PRO:AB Enterococcus faecalis gene e EM_PRO:AB Enterococcus faecalis gene e-57AlignmentDB:IDSource LengthIdentity%Ungapped% EM_PRO:AB EM_PRO:AB EM_PRO:AB EM_PRO:AB EM_PRO:AB EM_PRO:AB Streptococcus epidermidis g e % Similarity Speziesgrenze 96% Similarity Genusgrenze

39 Tendogramm Clone

40 Fragestellung Verursachen alle (kultivierbare/nicht- kultivierbare) MOs im Blut klinische Probleme? Welche nicht-kultivierbaren MOs sind im Blut neutropenischer/septitischer Patienten? Woher kommen diese MOs/Wie gelangen sie ins Blut des Patienten? Was kann man dagegen tun? KLINISCHE BEDEUTUNG

41 Wozu molekulare Analyse ? Blutkultur oft negativ Gewisse Menge an Keimen muss vorhanden sein Keime müssen kultivierbar sein Zeit Probenmenge 99% der Bakterien weltweit sind unbekannt NUR 1% ALLER BEKANNTEN BAKTERIEN WACHSEN UNTER LABORBEDINGUNGEN

42 Probleme bei der Extraktion bakterieller DNA aus Vollblut Gelelektrophorese

43 Probleme bei der Extraktion bakterieller DNA aus Vollblut Gelelektrophorese Staphylococcus specific Primers Enterobacteriaceae/Pseudomonadaceae specific Primers

44 Probleme bei der Extraktion bakterieller DNA aus Vollblut DGGE

45 Lokalisierung der Bakterien im Blut: Fluorescents Insitu Hybridisation unspikedspiked m. E.coli u. S.flexneri Shigella- Sonde E.coli- Sonde

46 Spezielle DNA- Extraktionsmethode Selektive Lyse der Blutzellen Verdau der Blut- DNA Inaktivierung der DNase Lyse der Bakterienzellen Reinigung der bakteriellen DNA Extraction Protocol in cooperation with Fa. MOLZYM

47 Spezielle DNA- Extraktionsmethode Gelelektrophorese

48 Spezielle DNA- Extraktionsmethode

49 DGGE

50 Abwesenheit v. Blut-DNA

51 Sensitivität


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