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Nachweis von Calciumdipicolinat in Bacillus subtilis Endosporen mittels energiedispersiver Röntgenbeugung von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger.

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Präsentation zum Thema: "Nachweis von Calciumdipicolinat in Bacillus subtilis Endosporen mittels energiedispersiver Röntgenbeugung von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger."—  Präsentation transkript:

1 Nachweis von Calciumdipicolinat in Bacillus subtilis Endosporen mittels energiedispersiver Röntgenbeugung von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger

2 Übersicht Motivation Messapparatur -Aufbau -Optimierung der Einstellungen -Durchführung der Messungen Auswertung -Normierung der Messdaten -Faltung der Messdaten -Korngrößenabhängigkeit Zusammenfassung & Ausblick Quellen Seite 2 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger

3 Übersicht Motivation Einschub: Energiedispersive Röntgenbeugung Messapparatur -Aufbau -Optimierung: Simulation -Messung Auswertung -Normierung -Faltung -Korngröße Zusammenfassung & Ausblick Quellen Seite 3 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger

4 Motivation – Bacillus subtilis Seite 4 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Bakterium Bacillus subtilis ist Endosporenbildner Endosporen Ähnlichkeit zu -Bacillus anthracis -Clostridium botulinum -Clostridium tetani Große Mengen von kristallinem Ca-DPA im Core Rest besteht aus nicht- kristallinen Proteinen, DNA, etc…

5 Motivation – Calcium Dipicolinat (Ca-DPA) Seite 5 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Ca-DPA ist Salz der Dipicolinsäure, welche ebenfalls in einigen Sporen zu finden ist. Ca-DPA = C 7 H 3 CaNO 4 bildet monoklines Gitter mit 4 Molekülen / Zelle Spektroskopisch viel untersuchte Substanz, jedoch kaum mittels EDX. Detektion interessant für Brief- & Paketscanner etc.

6 Einschub – Energiedispersive Röntgenbeugung (I) Seite 6 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Röntgenstrahlung der Energie E hat Wellencharakter Interferenzphänomene Bragg-Gleichung Strukturanalysen winkel- und energiedispersiv möglich

7 Einschub – Energiedispersive Röntgenbeugung (II) Seite 7 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Kristallstruktur festgelegt durch 14 Bravais-Gitter, sortiert nach Symmetrie (kubisch, tetragonal, rhombisch, …) Viele mögliche Streuebenen: Auch bei hohen Symmetrien viele Beugungsreflexe!

8 Messapparatur – Schematischer Aufbau Seite 8 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger fokussierter Röntgenstrahl 3D - Objekt Primär- kollimator Streu- kollimator L Objektpunkt eff. Streuwinkel x z q s q p Fokus

9 Messapparatur – Änderung des Messwinkels Seite 9 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger x y L z x z y L

10 Messapparatur – Änderung der Streublendenöffnung Seite 10 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger x z y A A x z y A A

11 Röhren-Parameter & Datenaufnahme Seite 11 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger wesentliche Bestandteile der Röntgenanlage X-Ray-Tube (Philips) mit Wolfram-Röntgenanode: energieauflösender Ge-Halbleiter-Detektor (Eurisys Mesures) Röhren-Parameter Beschleunigungspannung bis 150keV Anodenstrom bis 10mA Datenaufnahme Vorbereitungen für die Datenauswertung Energie-Kanal-Eichung mittels charakteristischer Linien: in Kanal ; in Kanal Detektorspannung ( E) Vorverstärker MCA (2048 Kanäle) mit ADC winTMCA (PC-Software) Kanalnummer Energie [keV]

12 Normierung des Beugungsspektrums Seite 12 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Problem: Lösung: Vorgehensweise: 1.Aufnahme des Transmissionsspektrums: Detektion ungebeugter Photonen bei geringem Anodenstrom (I=1mA um Detektor nicht zu schädigen) 2.Division des Beugungs- durch das Transmissionsspektrum (Für manche Energien ist die Intensität im Transmissionsspektrum nahe null Hohe Intensitäten im Divisionsspektrum, allerdings lediglich in uninteressanten Randbereichen.) Strahlungsintensität über Energien nicht konstant (aufgrund Bremsstrahlung & charakteristischer Linien) Normierung des Beugungsspektrums mittels Transmissionsspektrum: Abgesehen von Rauscheffekten lässt sich so obige Intensitätsabhängigkeit herausfiltern

13 Messapparatur – Optimierung (I) Seite 13 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Vormessung mit Dipicolinsäure Bestimmung der Netzebenen- abstände d mittels Gauß-Fit d [A]rel. Intensität

14 Messapparatur Optimierung (II) – mit xSim2001 v1.0 Seite 14 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger xSim2001 v1.0 Im Rahmen einer Diplom-Arbeit für diese Röntgenanlage erstelltes Simulationsprogramm basierend auf Monte Carlo Verfahren Anlagenparameter einstellbar (Blendenöffnungen, Winkel, ROI, zu untersuchendes Objekt sowie dessen Position) Simulation von Messungen (mit d-Werten) Durchführung von Simulationsläufen für verschiedene Blendensysteme und Beugungswinkel Ermittlung optimaler Parametereinstellungen entsprechende Konfiguration der Röntenbeugungsanlage Ergebnisse der besten Simulationen (Spektren) Primäre Beugungsblenden: 1te Konfiguration: oben:0.4 mm, unten 0.25 mm 2te Konfiguration oben:1.5 mm, unten:1.25 mm Sekundäre Beugungsblenden: gleiche Konfig. oben: 4.7/5.6 mm, unten 12.9/14 mm Beugungswinkel: 38mrad

15 Messapparatur Optimierung (II) – xSim2001 v1.0 Screenshot Seite 15 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Darstellung simulierter Beugungsmessungen

16 Messapparatur – Messung (I) Seite 16 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Im Folgenden führten wir folgende Messungen durch: 1. Messung: Ca-DPA mit kleinen Blenden + Transmission 2. Messung: Ca-DPA mit großen Blenden + Transmission 3. Messung: Sporen + Untergrund + Transmission

17 Messapparatur – Messung (II) Seite 17 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Ca-DPA Messung bei einem Winkel von 38mrad Primärblenden: 0.4mm / 0.25mm 1.5mm / 1.25mm

18 Messapparatur – Messung (III) Seite 18 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Sporen Messung bei einem Winkel von 38mrad Primärblenden: 1.5mm / 1.25mm Gemessene SpektrenDivisionsspektrum

19 Auswertung – Normierung (I) Seite 19 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Division der Spektren, dann: -Fit der Peaks und Bestimmung/Vergleich der d-Werte -Untersuchung der Peakverbreiterung -Rekonstruktion

20 Auswertung – Netzebenen (II) Seite 20 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Vergleich der d-Werte zu Referenz [1] Gute Übereinstimmung bei gleichen Anlagenparametern (kleine Blendenkonfiguration) Verschiebung zu größeren d-Werten bei größeren Blenden (wg. Asymmetrie) PeakEnergie [keV]d [Å]Abweichung [%] ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

21 Auswertung – Blendenverbreiterung (III) Seite 21 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Aus der Winkelunsicherheit ΔΘ folgt eine Peakverbreiterung -Bragg-Gleichung liefert Energie … und daher Unsicherheit -Winkelunsicherheit nicht exakt bekannt Experimentelle Verbreiterungen aus Gauß-Fits werden gewichtet gefittet (Verbreiterungsfaktoren) Abschätzung zeigt Überein- stimmung mit Größenordnung

22 Auswertung – Faltung (I) Seite 22 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Diskrete Faltung: Problem: Nicht-konstanter Faltungskern verursacht im diskreten Fall stark nicht-stetige Resultate -Blendenverbreiterung ΔE ~ E -Korngrößenänderung ΔE ~ 1/E Abhilfe: Spline-Interpolation zwischen zwei Kernen Realisierung eines Algorithmus mit Matlab

23 Auswertung – Faltung (II) Seite 23 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Verwendung von Gaußkernen Beispiel: Faltung von zwei Peaks mit lin. Verbreiterung ~ E

24 Auswertung – Faltung (III) Seite 24 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Rekonstruktion der gemessenen Ca-DPA-Spektren aus -d-Werten -Intensitäten -Verbreiterungsfaktoren

25 Auswertung – Faltung (IV) Seite 25 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Vergleich mit Simulation Fehlende d-Werte werden bestätigt Ähnlich Resultate, jedoch geringere Übereinstimmung

26 Auswertung – Faltung (V) Seite 26 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Ziel: Rekonstruktion des relevanten Bereich des Sporenspektrums aus Ca-DPA Spektrum Algorithmische Minimierung der Differenzspektren in Maximumnorm Annahmen -Generelle Verschmierung durch biologische Probe (Grundverbreiterung) -Korngrößenverkleinerung des kristallinen Ca-DPA (Scherrerverbreiterung)

27 Auswertung – Faltung (VI) Seite 27 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Faltung von Ca-DPA Spektrum mit Verbreiterungskern Aufgabe: Suche Verbreiterung, s.d. Abstände der beiden Maxima im Sporenspektrum mit denen im gefalteten Spektrum etwa übereinstimmen:

28 Auswertung – Korngröße (I) Seite 28 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Problem: Linker Peak weist zuwenig Intensität auf Möglicher Grund: Korngrößenverkleinerung Scherrer – Formel -Hier ist Δ die Peakverbreiterung, K der Scherrer-Formfaktor und L die Korngröße -Kleine Kristallite Größere Verbreiterung Idee: Faltung des verbreiterten Spektrums mit einem gemäß 1/E verbreiternden Kerns.

29 Auswertung – Korngröße (II) Seite 29 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger 1/E Kernverhalten kann ersten Peak vergrößern Recht gute Übereinstimmung, Abweichung 8-10 % Aber: Zu ungenau – Verbreiterung korrespondiert zu Korngrößen im Bereich ~1nm nach Scherrer

30 Fazit - Ist Ca-DPA in den Sporen nachweisbar...? Seite 30 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Zusammenfassung Vormessung & Simulation wichtige Voraussetzung zur Parameter-Optimierung Messung und Auswertung der aufgenommenen Spektren Bestimmung der d-Werte, Intensitäten Halbwertsbreiten Matlab-Analyse zur Rekonstruktion Sporen-Spektrums aus Ca-DPA-Spektrum mittels Faltung Fazit / Ausblick Spektrum konnte mittels Faltung rekonstruiert werden Ursachen der Verbreiterung nicht gänzlich geklärt Bilden eines Entfaltungskern: Sporen Ca-DPA Kurze Messzeiten & schnelle Algorithmen zur Auswertung für spätere kommerzielle Anwendung notwendig

31 Quellen 1.Möglichkeiten zur Identifikation von Bakterien-Endosporen durch kohärente Röntgenstreuung Diplomarbeit 2004 DANIELA FELLINGER 2.The Crystal Structure of Calcium Dipieolinate Trihydrate (A Bacterial Spore Metabolite) Acta Cryst. (1968). B 24, 571 GERALD STRAHS AND RICHARD E. DICKERSON 3.Quantitative simulation of coherent X-ray scatter measurements on bulk objects Journal of X-Ray Science and Technology 12 (2004) H. Bomsdorf, T. Müller, H. Strecker 4.Wikipedia Commons Seite 31 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger

32 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit & Interesse Seite 32 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger


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