Proteine II Chromatographie und Dialyse

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1 Proteine II Chromatographie und Dialyse
Dr. Richard Weiss

2 Isolierung von Proteinen
> Proteine im menschlichen Organismus, beträchtlicher Teil davon nicht oder nur über die biologische Aktivität definiert Zur vollständigen Charakterisierung einige mg gereinigtes Protein benötigt Eigenschaften wie Größe, Löslichkeit, Ladung und spezifische Bindungsaktivität zur Reinigung eines Proteins in seiner aktiven Form benutzt Dialyse: Trennung der Proteine von kleineren Molekülen Gelchromatographie: Genauere Trennung aufgrund der Größe Die Ionenaustauschchromatographie trennt Proteine nach ihrer Nettoladung. Die Affinitätschromatographie nutzt die Affinität von Proteinen zu bestimmten chemischen Gruppen oder Liganden.

3 Dialyse Bei der Proteinreinigung entstehen oft Lösungen, die in ihrer Ionenstärke oder Pufferzusammensetzung für den nächsten Reinigungsschritt ungeeignet sind, daher Abtrennung von Salzen und hydrophilen Verunreinigungen nötig Die am längsten bekannte Entsalzungsmethode ist die Dialyse. Das Prinzip beruht auf einer semipermeablen Membran: lässt kleine Moleküle und Ionen frei diffundieren, hält größere Moleküle zurück Cellulosemembranen haben unterschiedliche Porengröße (Ausschlussgröße oder Cutoff-Wert). Ausschlusswert = Molekulargewicht der Proteine, die zu 90% von der Membran ausgeschlossen werden. © Stryer: Biochemie

4 Dialyse Proteinlösung luftfrei in Schlauch aus Dialysemembran gefüllt, mit Klammern verschlossen, von Puffer umgeben; Schlauch aus regenerierter Cellulose hergestellt, enthält Schwermetalle  in destilliertem Wasser auskochen und spülen. Schlauch zu maximal zwei Dritteln befüllt, Volumszunahme durch Wassereinwanderung während der Dialyse Diffusionsrate durch die Membran wird durch den Konzentrationsgradienten der diffundierbaren Teilchen, die Membranoberfläche, und die Temperatur bestimmt. © Stryer: Biochemie

5 Dialyse Puffer wird gerührt und einige Male gewechselt, für möglichst großen Konzentrationsgradienten an der Membranoberfläche Fortschritt der Entsalzung mittels Leitfähigkeitsmessung des Puffers überprüft. Bei weitgehender Entsalzung (Dialyse gegen Wasser): wegen der niederen Ionenstärke können Proteine teilweise ausfallen. Mit Dialyseschlauch auch Konzentration von Proben möglich, nicht von Puffer, sondern von hygroskopischem Material (z.B. Sephadex G100) umgeben, das durch die Membran Flüssigkeit und kleine Moleküle saugt. H2PO4- Na+

6 Ultrafiltration Für schnelle Konzentration von Proteinlösungen
Ultrafiltration wird nicht durch Konzentrationsgradienten getrieben, sondern durch Flussrate des Lösungsmittels durch die Membran. Dabei werden die Salze (Molekulargewicht <<<< Ausschluss-grenze) gemeinsam mit dem Wasser durch die Membran gepresst. Dazu Überdruck, Vakuum oder Zentrifugation verwendet. Probenvolumen ohne signifikante Änderung der Salzkonzentration verringert.

7 Chromatographie Trennmethode, bei der eine gelöste Substanzmischung mit Hilfe eines Gas- oder Flüssigkeitsstromes über eine stationäre Phase geleitet und dabei in die einzelnen Bestandteile der Mischung aufgetrennt wird. Gaschromatographie (GC) oder Flüssigkeitschromatographie (LC) Zu trennende Substanzmischung = Analyt Das Laufmittel = die mobile Phase, vermittelt die Wechselwirkung des Analyten mit der spezifischen Oberfläche einer stationären Phase (chromatographische Säule). Unveränderte Lösungsmittelzusammensetzung der mobilen Phase während der Trennung: isokratischer Trennung Änderung des Lösungsmittelgemisches (pH oder Salzgehalt) im Verlauf der Elution: Gradiententrennung

8 Ausrüstung Trennsäule, Lösungsmittelpumpe(n), Probenaufgabe, evtl. automatischer Probengeber (autosampler), Detektion (UV-Durchflussphotometer), Fraktionssammler (fraction collector) Trennsäule wird von der mobilen Phase bei atmosphärischem Druck (offenes System) durchströmt oder unter erhöhtem Druck FPCL (fast protein liquid c.) < 5 bar HPLC (high performance liquid c.) > 50 bar Manuelle Steuerung der einzelnen Systemkomponenten oder über einen Computer Chromatogramme mittels Schreiber oder am Computer aufgezeichnet

9 Stationäre Phasen Gepackte Trennsäule: Stahl- oder Glasrohr mit Füllmaterial: Partikel von einheitlicher Größe poröse Partikel: ermöglichen Eindringen von Probenmolekülen < Partikelporen in das innere Volumen (Permeation), äußere und innere Oberfläche des Füllmaterials steht für Wechselwirkung mit den Analyten zur Verfügung Je kleiner der Durchmesser der Partikel, desto besser die Auflösung Partikel von 3-100µm, Porenweite von nm Trägermaterialien sind: Biopolymere (Cellulose, Dextran, Agarose), synthetische Polymere (Polyacrylamid, Methacrylat, Polyvinylbenzol/Polystyrol) oder anorganische Polymere (Kieselsäure, Hydroxyapatit, Silica) An das Trägermaterial werden kovalent funktionelle Gruppen gebunden, die für die Trennmethode spezifisch sind Abhängigkeit der Trennschärfe von der Partikelgröße Geringere Porengrösse ergibt deshalb höhere Trennschärfe, weil die Diffusion der Probemoleküle in die Poren und wieder heraus erleichtert ist und dadurch die Zeit (und das Volumen), bis sich ein Equilibrium zwischen mobiler und stationärer Phase einstellt, geringer ist. Mehr Poren auf engerem Raum!

10 Chromatographie - Theorie
Nach Probenauftrag wandern die unterschiedlichen Komponenten als Banden in Abhängigkeit von der Elutionsmethode mit unterschiedlicher Geschwindigkeit durch die Säule. Detektion beim Austritt Dokumentation im Chromatogramm: die eluierten Komponenten werden als Peak gegen die Zeit oder das Elutionsvolumen aufgezeichnet Das Ausschlussvolumen (V0) entspricht dem Volumen des Raums zwischen den Partikeln Das innere Volumen (Vi) entspricht dem Volumen der Poren in den Partikeln Das Gesamtvolumen (Vt) ist demnach V0 + Vi. Optimale Bedingungen erzeugen schlanke, symmetrische Proteinpeaks

11 Gelchromatographie Auftrennung der Proteine nach Größe
Probe auf eine Säule aus porösen Kügelchen aufgetragen Bestehen aus unlöslichem, aber stark hydratisierten Polymer (Dextran, Agarose oder Polyacrylamid; im Handel als Sephadex, Sepharose oder Bio-Gel) Kleine Moleküle können in die Kügelchen eindringen, große nicht. Kleine Moleküle verteilen sich in der wässrigen Lösung innerhalb der Kügelchen und zwischen ihnen, große Moleküle nur dazwischen Große Moleküle passieren die Säule schneller und verlassen sie zuerst, weil ihnen nur ein kleines Volumen (nämlich V0) zugänglich ist. © Stryer: Biochemie

12 Gelchromatographie Nachteile bei großen Mengen und Volumina am Anfang eines Reinigungsganges: Probenvolumen darf 5% des Säulenvolumens nicht übersteigen Gelchromatographiesäulen können mit Proteinen schnell überladen werden – Vermischung von Protein- und Salzbereichen Trennung bei geringer Flussrate besser – lange Analysezeit Volumen der Ausgangsprobe wird mindestens verdreifacht – anschließende Konzentrierung oder konzentrierendes Trennverfahren (Affinitäts-, Ionenaustauschchromatographie) nötig

13 Affinitätschromatographie
Nutzt die hohe Affinität vieler Proteine zu bestimmten chemischen Gruppen oder Liganden. Man kann z.B. das pflanzliche Protein Concanavalin A über eine Säule reinigen, die kovalent gebundene Glucosereste enthält. Con A besitzt im Gegensatz zu den meisten Proteinen eine Affinität zu Glucose. Durch Zugabe einer konzentrierten Glucoselösung kann das gebundene Con A von der Säule eluiert werden. Die Glucosemoleküle in der Lösung verdrängen die säulenfixierten Glucosereste von den Bindungsstellen auf dem Con A. Diese Technik besitzt eine geringe Trennkapazität (1), aber eine extrem hohe Selektivität, da in einem Schritt aus einer komplexen Mischung ein einzelnes Protein isoliert werden kann. © Stryer: Biochemie

14 Ionenaustauschchromatographie
Trennung der Proteine aufgrund ihrer Nettoladung Oft erster Schritt einer Proteinreinigung Grundlage ist kompetitive Wechselwirkung geladener Ionen: Probenmolekül konkurriert mit Salz-Ionen um geladene Positionen auf einer Ionenaustauscher-Matrix Zuerst bindet das Molekül an die fixierten Ladungen der stationären Phase, dann folgt Verdrängung und Elution des Proteins durch steigende Salzkonzentration des Eluenten Anionenaustauscher: Negativ geladene (anionische) Proteine werden in Säulen mit positiv geladenen funktionellen Gruppen, zB Diethylaminoethyl (DEAE), getrennt. Kationenaustauscher: Positiv geladene (kationische) Proteine werden mit Hilfe von negativ geladenen Gruppen, zB Carboxymethyl (CM), abgetrennt. © Löffler/Petrides: Biochemie und Pathobiochemie

15 Ionenaustauschchromatographie
Proteine tragen aufgrund saurer oder basischer Seitenketten einzelner AA negative oder positive Ladungen. Im sauren pH-Bereich sind die Aminogruppen (von Lys, Arg, His) protoniert und das Protein verhält sich kationisch. Im basischen Bereich überwiegen die negativen Ladungen an den Seitenketten von Asp und Glu, das Protein tritt als Anion auf. Die Gesamtladung ist also abhängig vom pH der Umgebungslösung – amphoteres Verhalten. AA-Komposition bestimmt den isoelektrischen Punkt pI eines Proteins; dieser charakterisiert den Neutralpunkt, an dem sich positive und negative Ladungen kompensieren Überwiegen negativ geladene AA-Seitengruppen – niedriger pI < 6 – saures Protein Proteine mit pI > 8 als basisch bezeichnet

16 Beispiel - Kationenaustauscher
pH-Bereich nahe pI: schwache Wechselwirkung des Proteins mit Ionenaustauscher, wird stärker, je mehr sich pH und pI unterscheiden Je stärker das Protein geladen, desto stärker die Bindung an den Ionenaustauscher Starke Ionenaustauscher: funktionelle Gruppen, die über weiten pH-Bereich den Ladungszustand beibehalten Elution durch Salzgradienten (NaCl, KCl) – stärker geladene Proteine werden fester zurückgehalten und eluieren erst bei hoher Ionenstärke

17 Trennkapazität © Lottspeich/Zorbas: Bioanalytik

18 Praktischer Teil Kälberserum: Ausfällen der Proteine mittels Ammoniumsulfat Große Mengen an Ammoniumsulfat würden bei SDS-PAGE stören A. Entsalzen einer Proteinlösung (Pellet aus AS-Fällung) mittels Dialyse B. Entsalzen derselben Proteinlösung mittels Gelchromatographie C. Bestimmung der Proteinkonzentration der Fraktionen der Gelchromatographie sowie des Dialysats mittels Bradford-Färbereaktion D. Messung der Leitfähigkeit (Salzkonzentration) vor und nach Entsalzung

19 A. Dialyse 200µl der Probe (Pellet aus AS-Fällung) in Dialysekapsel pipettiert Dialysemembran zwischen Deckel und Kapsel geklemmt Kapsel in Becherglas mit destilliertem Wasser Dialyse erfolgt auf Magnetrührer Bestimmen der Proteinkonzentration und der Leitfähigkeit der Probe nach der Dialyse Die entsalzte Probe wird für das nächste Übungsbeispiel gefroren aufbewahrt

20 B. Säulenchromatographie
Fertig gepackte NAP-5 Säulchen Gefüllt mit Sephadex G-25 (Polydextran) Ausschlussgröße von 10kD, entspricht der Dialysemembran

21 B. Säulenchromatographie
100µl der Proteinlösung auf die Säule Eluat in Mikrotiterplatte aufgefangen (2 Tropfen pro Well, ca. 100µl) Protein- und Salzkonzentration der einzelnen Fraktionen bestimmt 3 Fraktionen mit der höchsten Proteinkonzentration für das nächste Übungsbeispiel gefroren aufbewahrt

22 C. Proteinbestimmung Proteinkonzentration der Fraktionen aus der Säulenchromatographie, der Ausgangsprobe, und des Dialysats mittels Bradford-Assay bestimmt BSA Eichgerade zum Umrechnen der OD Werte in mg/ml

23 C. Proteinbestimmung

24 D. Salzkonzentration Wir schließen von der elektrischen Leitfähigkeit (µS) auf die Ionenkonzentration (mmol/l): Messen der Leitfähigkeit der Ausgangsprobe, der 3 gepoolten Fraktionen, des Dialysats, und des Aussenmediums der Dialyse Ammoniumsulfat Eichgerade

25 D. Salzkonzentration Wir kennen jetzt von unseren Proben die Proteinkonzentration in mg/ml und die Salzkonzentration in mM (=µmol/ml) Das Molekulargewicht von Ammoniumsulfat beträgt g/mol, dh. eine Ammoniumsulfatkonzentration von 1 µmol/ml entspricht µg/ml Daraus berechnen wir den Salzgehalt der Proben in µg(Salz) pro mg(Protein)

26 D. Salzkonzentration Beispiel: 1µmol/ml = 132,14µg/ml 140µmol/ml = x
Proteinkonz. (mg/ml) Salzkonz. (mM) Salzkonz. (µg/ml) Salzgehalt (µg/mg) 2 140 18500 9250 1µmol/ml = 132,14µg/ml 140µmol/ml = x