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Chromatographie 2 Einführung: GC und HPLC. Gaschromatographie (GC) Grundlage ist die Verteilung des Analyten zwischen einer gasförmigen mobilen und einer.

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Präsentation zum Thema: "Chromatographie 2 Einführung: GC und HPLC. Gaschromatographie (GC) Grundlage ist die Verteilung des Analyten zwischen einer gasförmigen mobilen und einer."—  Präsentation transkript:

1 Chromatographie 2 Einführung: GC und HPLC

2 Gaschromatographie (GC) Grundlage ist die Verteilung des Analyten zwischen einer gasförmigen mobilen und einer flüssigen stationären Phase

3 Stationäre Phase zEigenschaften - Geringe Flüchtigkeit (hoher Siedepunkt >400 °C) - Thermische Stabilität - Chemische Inertheit zImmobilisierte Flüßigkeiten Polarität ausschlaggebend; meist hochsiedende Silikonöle DB-1, HP-1, CP-1 = Polydimethylsiloxan (unpolar) DB-5= Poly(phenylmethyl)dimethylsiloxan (5% Phenyl) Carbowax = Polyethylenglycol (polarer) GC

4 Trennsäulen zGepackte Säulen ca. 2 m lange Glassäulen; Innen-Ø 2 mm Trägermaterial (z.B. Kieselgur, Ø µm) Stationäre Phase als Film auf Träger ( µm) zKapillarsäulen Quarzsäulen mit Polyimidbeschichtung (flexibel!) m lang; Innen-Ø von mm Stationäre Phase als Film an der Kapillare (FSOT) Filmdicke µm GC

5 Mobile Phase Mobile Phase tritt nicht mit dem Analyten in Wechselwirkung, sondern sorgt nur für den Transport des Analyten durch die Säule ! zEigenschaften Inertes Gas (H 2, He, N 2 ); sauerstofffrei zFlußraten (Kapillarsäulen) Massefluß: mL min -1 Lineare Strömungsgeschwindigkeit (µ) cm s -1 GC

6 Mobile Phase & Trennung zEinfluß der Fließgeschwindigkeit auf die Trennung (Bandenverbreiterung) GC van Deemter

7 van Deemter Gleichung GC Massentransferkoeffizient (C) Diffusionskontrolierter Massetransfer zwischen stationären und mobiler Phase. Linear von der Geschwindigkeit abhängig Die in der mobilen Phase befindlichen Moleküle wandern weiter, während sich jene die aus der stationären Phase zurückkehren nur verzögert in die Bande eingleidern können  Bandenverbreiterung

8 van Deemter Gleichung GC Eddy-Diffusion (A) Streudiffusion aufgrund ungleicher Substanzwanderung. Geschwindigkeitunabhängige Komponente

9 van Deemter Gleichung GC Longitudinal-Diffusion (B) Diffusion entlang der Längsachse der Säule (in Flußrichtung) Komponente nimmt mit zunehmender Geschwingigkeit ab.

10 van Deemter Gleichung GC H = A + + C. µ BµBµ A B C

11 Trägergasversorgung Druckregelung zSäulenvordruck wird eingestellt (column head pressure) ca hPa zDurchflußmessung mittels Blasenzähler am Ende der Säule GC Trägergasflüsse Wenn Temperatur gesteigert wird, fällt bei gleichbleiben-den Druck die lineare Ge- schwindigkeit ! Abhilfe schafft eine elektronische Druckregelung, die die lineare Geschwindig- keit konstant hält.

12 Injektor Injektor: Probenaufgabe zEinspritzvolumen so klein als möglich (0.5-1 µL) z„on-column injector“ (direkte Einspritzung) z„split/splitless injector“ (indirekte Einspritzung) Insert Probengeber GC

13 Gasversorgung & Injektor GC

14 Split/Splitless-Injektor GC

15 Temperatur & Säulenofen Säulentemperatur zWichtige Variable! Elutionstemperatur muß höher sein als die Siede-temperatur des Analyten zProben unterschiedlicher Siedetemperatur werden mit einem Temperaturprogramm aufgetrennt zSäulenofen zur Thermo- statierung (kontinuierliche T-Erhöhung) GC 45° 145° °

16 Detektoren Eigenschaften zAusreichende Empfindlichkeit zGute Stabilität zGute Reproduzierbarkeit zGroßer linarer Bereich zSchnelle Ansprechzeiten zSelektivität zHoher Temperaturbereich GC Arten von Detektoren FID (Flammenionisations- detektor) TCD (Wärmeleitfähigkeits- detektor) ECD (Elktroneneinfang- detektor) AED (Atomemissionsdetektor) GC-MS (Kopplung zu einem Massenspektrometer)

17 Flammenionisations-Detektor GC

18 GC-MS Kopplung GC

19 GC-MS Chromatogram GC

20 Derivatisierung GC zViele polare organische Moleküle sind nicht verflüchtigbar! zDerivatisierung: chemische Modifizierung, die die Analyte flüchtig(er) macht und gleichzeitig bei hohen Temperaturen stabilisiert zHäufig Methylierungen (z.B. Trimethylsilyl- Derivate) zSilylierung Übertragung einer TMSi- Gruppe [-Si(CH 3 ) 3 ] auf funktionelle Gruppen: - OH - COOH - NH 2 - SH zSilylierung muß im wasser- freien Milleu erfolgen! zPyridin + BSTFA + TMCS

21 HPLC MW Adsorption Verteilung Ionenaus- tausch RPNP Ausschluß PermeationGelfiltration Wasserunlöslich (unpolar) Wasserlöslich (polar, ionisch)

22 HPLC

23 Verteilungschromatographie zTrennung nach POLARITÄT! z(Flüßig-Flüßig-Chromatographie oder) Chromatographie an chemisch gebundenen Phasen Stationäre Phasen: Silikagele (3-10 µm) modifiziert mit z.B. C18 (ODS), C4 -, Aminogruppen HPLC R ODS Silikagel

24 „Reversed Phase“ zNormalphasen polare stationäre Phase + unpolare mobile Phase (z.B. Aluminiumoxid/H 2 O + Hexan) zUmkehrphasen (Reversed Phase) unpolare stationäre Phase + polares Lösungsmittel (z.B. ODS + Methanol/Acetonitril) HPLC CBA t Polarität: A > B > C A B C t

25 Adsorptionschromatographie zKieselgele oder Aluminiumoxide als stationäre Phasen zZur Trennung kann nur die Polarität der mobilen Phase geändert werden zAls Ergänzung zur Verteilungschromatographie, wenn Substanzen stark unpolar sind (in polaren Lösungs- mitteln schwer löslich sind) zSehr gut für Isomeren-Trennung geeignet HPLC

26 Ionenchromatographie zStationäre Phasen sind Ionenaustauscher (meist Kunstharze auf Polystyrenbasis) mit immobilisierten geladenen funktionellen Gruppen: Anionenaustauscher:[ — N(CH 3 ) 3 + OH - ] Kationenaustauscher:[ — SO 3 - H + ] zMobile Phasen sind Elektrolyte Niedrigkonzentrierte Salzlösungen,Säuren oder Basen Elution erfolgt entweder durch Erhöhung der Ionenstärke oder durch pH-Änderung! HPLC

27 Supressortechnik zProblem in der Ionenchromatographie: Eigenleitfähigkeit des Eluenten HPLC

28 Anwendungen der Ionenchromatographie zAuftrennung von organischen und anorganische Ionen (insbesondere von Anionen, für die nur wenige verläßliche Trennmethoden existieren) zBestimmung von Kohlenhydraten an Anionentauschern (KH sind im alkalischen Millieu geladen!) zBestimmung von Aminosäuren an Kationentauschern (Aminosäuren sind amphotere Substanzen und im liegen unterhalb von pH=6 vollständig als Kationen vor) zWichtige Methode bei der Trennung von Proteinen (AEC an schwachen Anionenaustauschern) HPLC

29 Auschlußchromatographie zPoröse stationäre Phase (z.B. Polymerteilchen) zMobile Phase kommt in 2 Formen vor: fließend, zwischen den Teilchen stagnierend, in den Poren zAnalyte werden je nach Größe in die Poren der stationären Phase eindringen können, oder werden vom Poren ausgeschlossen. HPLC

30 Das HPLC-System HPLC Eluent Pumpe Einspritzventil Trennsäule Detektor

31 Injektoren HPLC Rheodyne

32 Detektoren HPLC Nachweisgrenzen zUV-Vis Detektor 1 ng zDiodenarray-Detektoren 1 ng zBrechungsindex-Detektor (RI) 1 µg zElektrochemischer Detektor (AD, PAD) 10 pg zLeitfähigkeitsdetektor (CD) 1 ng zFluoreszenz-Detektoren 10 pg zLichtstreu-Detektor 10 µg zHPLC-MS Kopplung 1 ng


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