29.05.20161 In-vitro- Genexpression von GFP Produktnachweis mittels SDS- PAGE Experimentelle Vorgehensweise und.

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1 29.05.20161 In-vitro- Genexpression von GFP Produktnachweis mittels SDS- PAGE Experimentelle Vorgehensweise und

2 29.05.20162 1.In einem zellfreien System von E. coli soll das Grün Fluoreszierende Protein (GFP) exprimiert werden. 2.Das Expressionsprodukt GFP soll mittels SDS-PAGE nachgewiesen und dessen molare Masse über eine Eichkurve ermittelt werden. Ziele des Experiments

3 29.05.20163 60 Minuten:Probenvorbereitung und Ansetzen der In-vitro-Genexpression 120 Minuten:Dauer der GFP-Expression oder länger (z.B. über Nacht) 70 Minuten:Durchführung der SDS-PAGE 30 Minuten:Gelauswertung und Bestimmung der molaren Masse von GFP Dauer des Experiments

4 29.05.20164 Lagerung des Kits Das Kit wird auf Trockeneis ange- liefert und kann im Kühlschrank bei –20°C über Monate aufbewahrt werden. Die Chemikalien im Kit reichen für die dreimalige Durchführung des Experiments mit 8 Arbeitsgruppen

5 29.05.20165 Experimentvorbereitungen 1.Ansetzen der Stammlösungen - Die entnommenen Aliquots aus den angesetzten Stammlösungen werden bis zum Versuchsbeginn im Eis aufbewahrt. -Die restlichen Stammlösungen können bei -20°C über Monate gelagert werden.

6 29.05.20166 Experimentvorbereitung 2.Wasserbad auf 30 o C erhitzen! 30°C

7 29.05.20167 Experimentvorbereitung 3. Herstellung von RNase-/DNase-freiem H 2 O 400 µl steriles H 2 O werden in einem verschlossenen Schraub- tube in der Mikrowelle 7 Minuten bei 600 Watt erhitzt.

8 29.05.20168 Experimentvorbereitung 4.Ansetzen des Elektrophorese-Puffers Der konzentrierte Tris/Glycin/SDS- Puffer (TGS) wird mit H 2 O dest. 1 : 10 verdünnt. Pro Kammer 350 ml: 35 ml konzentrierter TGS-Puffer + 315 ml H 2 O dest. (2 Kammern mit je 2 Gelen werden benötigt)

9 29.05.20169 Experimentvorbereitung 5.Gruppenarbeit: Aliquotieren der 8 Stammlösungen für 8 Arbeitsgruppen

10 29.05.201610 Experimentvorbereitung Gruppe 1: Aliquotieren der E.-coli-Lysat-Lösung 1.Beschriften Sie 8 rote Tubes mit Ihrer Gruppen- nummer. 2.Pipettieren Sie jeweils 12 µl der Stammlösung aus dem roten Vorratsgefäß 1 (VG 1, Gesamtvolumen 120 µl) in die 8 von Ihnen zuvor beschrifteten Tubes. 3.Geben Sie jeweils ein Tube an die 8 Arbeitsgruppen.

11 29.05.201611 Experimentvorbereitung Gruppe 2: Aliquotieren der Reaction mix Lösung 1. Beschriften Sie die 8 vorbe- reiteten grünen Tubes mit Ihrer Gruppennummer. 2.Pipettieren Sie jeweils 12 µl der Stammlösung aus dem grünen Vorratsgefäß 2 (VG 2, Gesamtvolumen 110 µl) in die 8 von Ihnen zuvor beschrifteten Tubes. 3.Geben Sie jeweils ein Aliquot an die 8 Arbeits- gruppen.

12 29.05.201612 Experimentvorbereitung Gruppe 3: Aliquotieren der Aminosäurelösung 1. Beschriften Sie die 8 vorbereiteten blauen Tubes mit Ihrer Gruppennummer. 2.Pipettieren Sie jeweils 14 µl der Stammlösung aus dem blauen Vorratsgefäß 3 (VG 3, Gesamtvolumen 130 µl) in die 8 von Ihnen zuvor beschrifteten Tubes. 3.Geben Sie jeweils ein Aliquot an die 8 Arbeits- gruppen.

13 29.05.201613 Experimentvorbereitung Gruppe 4: Aliquotieren der Methioninlösung 1. Beschriften Sie die 8 vorbereiteten gelben Tubes mit Ihrer Gruppennummer. 2.Pipettieren Sie jeweils 10 µl der Stammlösung aus dem gelben Vorratsgefäß 4 (VG 4, Gesamtvolumen 105 µl) in die 8 von Ihnen zuvor beschrifteten Tubes. 3.Geben Sie jeweils ein Aliquot an die 8 Arbeits- gruppen.

14 29.05.201614 Experimentvorbereitung Gruppe 5: Aliquotieren des Rekonstitutionspuffers 1. Beschriften Sie die 8 vorbereiteten pink farbigen Tubes mit Ihrer Gruppennummer. 2.Pipettieren Sie jeweils 7 µl Puffer aus Vorratsgefäß 5 (VG 5, Gesamtvolumen 70 µl) in die 8 von Ihnen zuvor beschrifteten Tubes. 3.Geben Sie jeweils ein Aliquot an die 8 Arbeits- gruppen.

15 29.05.201615 Experimentvorbereitung Gruppe 6: Aliquotieren des GFP-Vektors 1. Beschriften Sie die 8 vorbereiteten farblosen Tubes mit Ihrer Gruppennummer. 2.Pipettieren Sie jeweils 10 µl DNase-freies Wasser in die 8 von Ihnen zuvor beschrifteten Tubes. 3.Pipettieren Sie jeweils 1 µl GFP-Vektor aus VG 6 (Gesamtvolumen 16 µl) hinzu und durchmischen Sie durch Anschnippen. 4.Geben Sie jeweils ein Aliquot an die Arbeitsgruppen.

16 29.05.201616 Experimentvorbereitung Gruppe 7: Aliquotieren des Kaleidoskop-Standards 1. Beschriften Sie die 8 vorbereiteten Tubes mit Ihrer Gruppennummer. 2.Pipettieren Sie jeweils 12 µl des Kaleidoskop- Standards aus VG 7 (Gesamtvolumen 110 µl) in die 8 von Ihnen zuvor beschrifteten Tubes. 3.Geben Sie jeweils ein Aliquot an die Arbeitsgruppen.

17 29.05.201617 Experimentvorbereitung Gruppe 8: Aliquotieren des Lämmli-Puffers 1. Beschriften Sie die 8 vorbereiteten Tubes mit Ihrer Gruppennummer. 2.Pipettieren Sie jeweils 22 µl des Lämmli-Puffers aus VG 8 (Gesamtvolumen 200 µl) in die 8 von Ihnen zuvor beschrifteten Tubes. 3.Geben Sie jeweils ein Aliquot an die Arbeitsgruppen.

18 29.05.201618 Verteilen der Aliquots Jede Arbeitsgruppe hat nach dem Verteilen der aliquotierten Chemikalien folgende Tubes zum Ansetzen der In-vitro-Expression zur Verfügung:

19 29.05.201619 1. Ansetzen der In-vitro- Expression

20 29.05.201620 1. Ansetzen der In-vitro-Expression 1.1Pipettieren Sie in Ihr rotes Tube 1, das bereits 12 µl E.-coli-Lysat enthält: 1.10 µl Reactionmix (grünes Tube 2) 2.12 µl Aminosäuren (blaues Tube 3) 3.1 µl Methionin (gelbes Tube 4) 4.5 µl Puffer(pinkes Tube 5) 5.10 µl GFP-Vektor(farbloses Tube 6)

21 29.05.201621 Aufgabe: Prüfen Sie Ihren In-vitro- Ansatz im UV-Feld auf Fluoreszenz (Kontrolle)! 1. Ansetzen der In-vitro-Expression

22 29.05.201622 1. Ansetzen der In-vitro-Expression 1.2Inkubieren Sie Ihr Reaktionsgemisch 120 Minuten bei 30°C im Wasserbad. 30°C Eine Inkubation von bis zu 24 Stunden erhöht die GFP-Produktion!

23 29.05.201623 Auswertung In-vitro-Expression Stellen Sie nach 120 min Expressionsdauer im UV-Feld fest, ob das GrünFluoreszierende Protein exprimiert wurde.

24 29.05.201624 Durchführung der SDS-PAGE

25 29.05.201625 2. Vorbereiten der Gelplatte 2.1Schneiden Sie die Verpackung des Fertiggels entlang der vorgegebenen Linie auf und entnehmen Sie die Gelkassette.

26 29.05.201626 2. Vorbereiten der Gelkassette 2.2Schneiden Sie mit einer Rasierklinge oder einem Skalpell die Klebefolie der Gelkassette entlang der markierten unteren Linie ein und ziehen Sie den unteren Streifen ab.

27 29.05.201627 3. Vorbereiten der Elektrophoresekammer 3.1 Setzen Sie die Gelkassette mit der kürzeren Platte nach innen gerichtet in den Elektro- denstand ein. Setzen Sie auf der gegenüberliegenden Seite eine weitere Gelkassette oder eine Blindplatte ein. 3.2 Drücken Sie den Elektrodenstand im Klammerrahmen nach unten und schließen Sie die 2 Klemmklappen. 3.3Setzen Sie den Klammerrahmen mit dem Elektrodenstand in den Pufferbe- hälter ein. 3.4Ziehen Sie den Kamm.

28 29.05.201628 4. Befüllen der Kammer mit Puffer 4.1Befüllen Sie den Elektrodenstand mit 140 ml TGS-Puffer. 4.2Befüllen Sie den Pufferbehälter ebenfalls mit 200 ml TGS-Puffer.

29 29.05.201629 Vorbereiten der Elektrophoresekammer Tipp: Läuft der Puffer aus dem Klammerrahmen aus, Puffer wieder entfernen und Elektrodenstand erneut festklemmen. Läuft dennoch Puffer aus, kann der Pufferbehälter auf die gleiche Höhe mit Puffer wie im Elektrodenstand gefüllt werden.

30 29.05.201630 5. Probenvorbereitung für die PAGE 5.1Beschriften Sie ein neues farbloses Tube mit Ihrer Gruppennummer. 5.2Überführen Sie etwa 2 Stunden nach Beginn der In-vitro-Genexpression 20 µl aus dem roten Reaktionsgefäß in das zuvor be- schriftete Tube. 5.3Pipettieren Sie 20 µl Lämmli-Puffer (aus Tube 8) hinzu und vermischen Sie durch Anschnippen.

31 29.05.201631 6. Befüllen der Geltaschen Zwei Arbeitsgruppen arbeiten mit einem Fertiggel! Rechte und linke Geltasche bleibt frei!

32 29.05.201632 6. Befüllen der Geltaschen 6.1Befüllen Sie die Geltaschen mit: - 10 µl Kaleidoskop-Längenstandard (KL, Tube 7) - 10 µl Probe Arbeitsgruppe 1 (P1) - 10 µl Probe Arbeitsgruppe 2 (P2) - 10 µl Kaleidoskop-Längenstandard (KL, Tube 7) -- KL - P1 - - P2 - KL --

33 29.05.201633 7. Durchführung der Elektrophorese 7.1Schließen Sie die Gelkammer und starten Sie die Elektrophorese bei 200 V. 7.2Beenden Sie die Elektrophorese wenn Bromphenolblau den unteren Rand des Gels erreicht hat (Dauer: ca. 20 Minuten).

34 29.05.201634 8. Entnahme des Gels 8.1Entnehmen Sie den Klammerrahmen aus dem Pufferbehälter und dekan- tieren Sie den Puffer ab. (Puffer ist wieder verwendbar!) 8.2Entnehmen Sie die Gelkassette aus dem Elektrodenstand.

35 29.05.201635 9. Gelauswertung 9.1 Stellen Sie im UV-Feld fest, ob das Grün Fluoreszierende Protein exprimiert wurde. Markieren Sie die Bande. 9.2Ermitteln Sie die molekulare Masse von GFP anhand einer Eichkurve.

36 29.05.201636 ProteinFarbeMG MyosinBlau201090 u ß-GalactosidaseMagenta133730 u RinderalbuminGrün83559 u KarbonanhydraseViolett39559 u Sojabohnen-Trypsin-InhibitorOrange31405 u LysozymRot17408 u AprotininBlau7081 u Tab.: Molekulare Masse der Proteine im Kaleidoskop-Standard 9. Gelauswertung

37 29.05.201637 Ergebnis der SDS- Gelelektro- phorese (schematisch) + - KL = Kaleidoskop-Längenstandard; P1 = Probe 1; P2 = Probe 2 kD 200 -- KL - P1 - - P2 - KL -- 134 84 40 31 17 7 ???

38 29.05.201638 Mathematische Auswertung der Gelelektrophorese Erstellen einer Eichkurve mit Hilfe des Protein- Standards: Abmessen der Wegstrecken zwischen Tasche und Protein- Banden. ( Gemessen wird jeweils zwischen Unterkante Geltasche und Bandenmitte)

39 29.05.201639 Mathematische Auswertung der Gelelektrophorese Fügen Sie Ihre Messwerte [mm] des Kaleidoskop- Längenstandards und der GFP-Bande in die Tabelle des Arbeitsblattes „Eichkurve“ ein. Erstellen Sie eine Eichkurve und bestimmen Sie M GFP a) von Hand b) über die Excel-Tabelle. Zur Excel Auswertung

40 29.05.201640 Ergebnis Die molare Masse von GFP beträgt 27 000 U