Ji-Yoen Kang et al. Julia Majer Chimeric Cytochromes P450 Engineered by Domain Swapping and Random Mutagenesis for Producing Human Metabolites of Drug Ji-Yoen Kang et al. Julia Majer

Enzymfamilie der Cytochrom P450 (CYPs) Einleitung Enzymfamilie der Cytochrom P450 (CYPs) Hämproteine = Häme, als prosthetische Gruppe & Eisen-Ion als Zentralatom Ubiquitäres Vorkommen 57 verschiedene CYPs beim Menschen Lokalisation v.a. in der Leber (Inneren ER) Beteiligung an ca. 75 % aller metabolischen Reaktionen der auf dem Markt vorhandenen Arzneistoffe (Substanz → aktiven Metabolit → Wirkung) Substarte = körpereigene (Fett-, Gallensäure, Steroide) oder körperfremde Stoffe (Arzneimittel) Klasse: Oxidoreduktasen , genauer Monooxygenasen → wichtigste Reaktion: Hydroxylierung Übertragen Sauerstoffatom des Sauerstoffmoleküls auf ein Substrat → R–H + O2 + NADPH + H+ → R–OH + H2O + NADP+ → Reduktionsmittel: NADH/NADPH, Flavin/Flavoproteine oder Ferredoxin

P450 BM3 (CYP102A1) Einleitung Bacillus megaterium 1982 von Fulco‘s Group UCLA identifiziert Nicht membrangebunden Identisch zur eukaryotischen CYP4A Familie (hydroxylieren Fettsäuren) Natürliche Substrate: langkettige Fettsäuren (C12 bis C20) Besteht aus Häm(-Oxygenase)domäne (HämD) sowie den beiden C-terminalen Flavinadenindinukleotid- und Flavinmononukleotid-Domänen mit der NADPH - P450 Reduktase (ReduktaseD) Höchste katalytische Aktivität bei P450 Monooxygenasen

P450 BM3 Struktur Einleitung Bedeutung der FMN Domäne Transportiert Flavin Cofaktor von FAD zur P450 Häme Domäne Transportiert durch NADPH Oxidation hergestellte Elektronen Erleichterte Bewegung (10 Ᾰ) durch Linkerregion 3D Struktur Hydroxylierung am Eisen-Ion mittels Sauerstoff AW Munro et al., P450 BM3: the very model of a modern flavocytochrome null, Volume 27, Issue 5, 2002, 250–257 , http://dx.doi.org/10.1016/S0968-0004(02)02086-8

Vorgehensweise Ziel der Studie: Mögliche Rolle der ReduktaseD in Bezug auf die katalytische Aktivität der HämD „Domain Swapping“ der ReduktaseD von zwei CYP102A1 Mutanten: 1.) katalytisch hoch aktiven CYP102A1 HämD Mutanten (M13, M15, M16 und M17), zeigen hohe Aktivitäten gegenüber Lovastatin, 7-EC und Phenacetin 2.) CYP102A1.2 (=V2) natürliche Variante mit 20 Mutationen in der ReduktaseD, d.h. hohe Aktivität gegenüber Reduktase Substarten (z.B. Ferricyanide und Cytochrome C) Herstellung Mutanten durch direkte Evolution und Rationales Design Expression in E. coli DH5αF‘-IQ Zellen

→ Größe der Mutanten Bibliothek: 1,4 x 10 6 Vorgehensweise Hoch aktive CYP102A1 Mutanten (*HämD) CYP102A1.2 (V2) mit 20 Mutationen in der ReduktaseD Durch die Kombination der beiden Domänen wurden Chimäras erzeugt → „Domain Swapping“ Mittels Aktivität Assays gegenüber verschiedenen humanen P450 Substarten wurden Chimäras ausgewählt CYP102A1 Chimära (M13V2, M15V2, M16V2 & M17V2) Anlegen von Bibliotheken der Chimäras Random Mutagenesis mittels Error-Prone PCR an der HämD → Klonierung der amplifizierten Fragmente in Vektor → Transformation in E. coli DH5αF‘-IQ Zellen CYP102A1 chimäre Mutanten von M16V2 → 5,6 Mutationen pro 1.290 bp → Größe der Mutanten Bibliothek: 1,4 x 10 6

Vorgehensweise CYP102A1 chimäre Mutanten von M16V2 Whole-cell Assay →High Throughput Screening E. coli Zellen durchlaufen mehrere Wasch- und Inkubationsschritte in 96-Wellplatten Zugabe von p-Nitrophenol als Substrat & NADPH Regenerierungssytem Signal wird als Änderung der Farbintensität bei 510 nm gemessen (Microplate Reader) →Selektion von 19 Mutanten höchster Aktivität Katalytische Aktivität Assays → HPLC Typische humane P450 Substrate & Statine HMG-CoA Reduktase Inhibitionsassay Fettsäure Hydroxylierung →Selektion der Mutanten höchster Aktivität

1a. Katalytische Aktivität Assays mit humanen P450 Substraten Ergebnisse 1a. Katalytische Aktivität Assays mit humanen P450 Substraten Katalytische Aktivität/Total Turnover Number (TTN): Wie schnell kann ein Enzym ein Edukt zum Produkt umsetzten? WT zeigte keine katalytische Aktivität gegenüber den Substarten (<0,1 𝑚𝑖𝑛 −1 ) Acetaminophen (O-Deethylierung) 2-fach höhere Aktivität der M16V2 Mutanten Schmerzbehandlung & Fiebersenkung 7-Hydroxy-4-FC (O-Deethylierung) HämD Mutanten und Chimäras identisch (0,07 - 4,5 𝑚𝑖𝑛 −1 ) D12 zeigt 70-fache Erhöhung * Fluorogenes Substrat Muskelkrämpfen 6β-OH Chlorzoxazon (Hydroxylierung) B10 höchste Aktivität HämD Mutanten und Chimäras < 1.1 𝑚𝑖𝑛 −1 Intermediat in der Synthese von Paracetamol p-Nitrocatechol (Hydroxylierung) Fast alle Aktivität von ca. 140 𝑚𝑖𝑛 −1 *7-EFC = 7-Ethoxy-4-Trifluoromethylcoumarin

1b. Katalytische Aktivität Assays mittels Statine Ergebnisse 1b. Katalytische Aktivität Assays mittels Statine Zur Behandlung von Hyperlipidämie, genauer Hypercholesterinämie eingesetzt Sinken Cholesterinspiegel im Blut: Statin 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzym A (HMG CoA) Mevalonsäure Cholesterin werden von humanen CYP3A4 oxidiert HMG CoA-Reduktase Lovastatin Atorvastatin Simvastatin Fluvastatin

1b. Katalytische Aktivität Assays mittels Statine Ergebnisse 1b. Katalytische Aktivität Assays mittels Statine WT zeigt keine Aktivität Identisch 6‘β-OH Statine Chimäre Mutanten zeigen alle hohe Aktivitäten Vgl.: beim humanen CYP3A4 liegt TTN von Simvastatin bei 8,3/min 2 Hauptmetabolite 5-OH: D12 (23,2 𝑚𝑖𝑛 −1 ) 6-OH: G1 (13,2 𝑚𝑖𝑛 −1 ) 4-OH Atorvastatin G1 und M17V2 höchste Aktivität Viele zeigen kaum Aktivität

1b. Bestimmung kinetischer Parameter mittels Statine Ergebnisse 1b. Bestimmung kinetischer Parameter mittels Statine → Mittels TTN und Michaeliskonstante wurde die katalytische Effizienz der Enzyme bestimmt Substrat Enzyme 𝒌 𝒄𝒂𝒕 ( 𝒎𝒊𝒏 −𝟏 ) 𝑲 𝒎 (µM) 𝒌 𝒄𝒂𝒕 / 𝑲 𝒎 ( 𝒎𝒊𝒏 −𝟏 µ𝑴 −𝟏 ) Simvastatin M16 10 33 0.30 G1 126 332 0.380 Lovastatin 9.2 16 0.58 196 839 0.234 Fluvastatin 5.8 258 0.022 25 724 0.035 Atorvastatin 0.13 167 0.0008 1.1 422 0.0026 → G1 zeigt die höchste katalytische Aktivität ( 𝑘 𝑐𝑎𝑡 ), aber auch die niedrigste Affinität vom Enzym zum Substrat ( 𝐾 𝑚 ) → Nur minimal höhere katalytische Effizienz als M16 → Ausnahme: Bei Lovastatin hat M16 die höhere Effizienz

2. HMG CoA-Reduktase Inhibitionsassay Ergebnisse 2. HMG CoA-Reduktase Inhibitionsassay Statine hemmen die HMG CoA-Reduktase Hydroxylierte Metabolite zeigen vergleichbare inhibitorische Wirkung Simvastatin 6‘ß-OH Lovastatin Fluvastatin 5-/6-OH Atorvastatin 4-OH Konzentration 6 µM 1 µM Reduktase Aktivität 75 % 50 % 55 % 15 %

3. Fettsäure Hydroxylierung (GC) Ergebnisse 3. Fettsäure Hydroxylierung (GC) Laurinsäure (Dodecansäure) Kokosfett, Lorbeerfrucht Myristinsäure (Tetradecansäure) Muskatnussbutter, tierischen Fetten Palmitinsäure (Hexadecansäure) Palmöl, Rindertalg Hydroxylierung von CYP102A1 am ω-1, ω-2 und ω-3 Kohlenstoff → M15V2 höchsten Hydroxylierungs Aktivitäten bei Laurinsäure → M13V2 höchsten Hydroxylierungs Aktivitäten bei Myristin- und Palmitinsäure → Alle M16V2 Mutanten zeigten im Vergleich zum Wildtyp niedrige Aktivitäten

WT zeigte kaum katalytische Aktivitäten Zusammenfassung Domain Swapping war in einigen Fällen nützlich, um erhöhte Enzymaktivitäten hervorzurufe ReduktaseD ist essentiell für die katalytische Aktivität der CYP102A1 HämD WT zeigte kaum katalytische Aktivitäten G1 und H1 zeigten von den 19 chimären Mutanten die höchsten Enzymaktivitäten Mögliche Perspektiven der veränderten Cytochrome P450 Enzyme: Einsatz als industrielle Biokatalysatoren zur Produktion von Arzneistoffen & Metaboliten Statin Metabolite zur Behandlung von Störungen des Lipoproteinstoffwechsels

Fura A. 2006. Role of pharmacologically active metabolites in drug discovery and development. Drug Discov Today 11:133–142. Guengerich FP. 2002. Cytochrome P450 enzymes in the generation of commercial products. Nat Rev Drug Discov 1:359–366. Guengerich FP. 2006. Cytochrome P450s and other enzymes in drug metabolism and toxicity. AAPS J 8:E101–E111. Guengerich FP. 2009. Introduction: Human metabolites in safety testing (MIST) issue. Chem Res Toxicol 22:237–238. Kang JY, Kim SY, KimD, Kim DH, Shin SM, Park SH, Kim KH, Jung HC, PanJG, Joung YH, Chi YT, Chae HZ, Ahn T, Yun CH. 2011. Characterization of diverse natural variants of CYP102A1 found within a species of Bacillus megaterium. AMB Express 1:1 Landwehr M, Carbone M, Otey CR, Li Y, Arnold FH. 2007. Diversification of catalytic function in a synthetic family of chimeric cytochrome P450s. Chem Biol 14:269–278. Munro AW, Leys DG, McLean KJ, Marshall KR, Ost TW, Daff S, Miles CS, Chapman SK, Lysek DA, Moser CC, Page CC, Dutton PL. 2002. P450 BM3: The very model of a modern flavocytochrome. Trends Biochem Sci 27:250–257. Otey CR, Landwehr M, Endelman JB, Hiraga K, Bloom JD, Arnold FH. 2006. Structure-guided recombination creates an artificial family of cytochromes P450. PLoS Biol 4:e112.