Event-Specific Detection of Seven Genetically Modified Soybean and Maizes Using Multiplex-PCR Coupled with Olignucleotide Microarray Jia Xu, Shuifang Zhu, Haizhen Miao, Wensheng Huang, Minyan Qiu, Yan Huang, Xuping Fu and Yao Li (China, 2007) © ETH Zürich

Überblick Ziel des Papers Einleitung Material & Methoden Resultate Diskussion Qualität des Papers

Mittels Multiplex-PCR & einem Oligonukleotid Mikroarray Ziel des Papers Eine neue Methode zur Identifikation von unterschiedlichen GMO Ereignissen, basierend auf der einzigen und spezifischen Integrations- Junction - Sequenz zwischen dem DNA Genom der Wirtpflanze und dem integriertem Gen, zu entwickeln. Mittels Multiplex-PCR & einem Oligonukleotid Mikroarray

Einleitung Seit 1996 bis 2006 ist der GM Getreideanbau um das 60-fache weltweit angestiegen (vor allem in Entwicklungsländer) GM Sojabohnen ->58.6 Mio. Hektaren GTS 40-3-2 Herbizid tolerante Sojabohne GM Mais -> 25.3 Mio. Hektaren MON 810 Herbizid toleranter Mais Aufgrund der Lebensmittelsicherheit, Umweltrisiken und ethischen Gründen, wurden GMO „Labeling“ Vorschriften aufgestellt, zum Schutz des Konsumenten. -> Labeling- Grenzwerte: EU 0.9% ; Korea 3%; Japan 5%

Multiplex-PCR In der Multiplex-PCR Methode wird mehr als ein Primerpärchen verwendet. Das Ziel einer Multiplex-PCR ist, mehrere Segmente der Ziel DNA gleichzeitig zu amplifizieren. Diese PCR Methode ermöglicht eine Amplifikation von mehreren DNA Zielen in einem Schritt

Oligonucleotid - Mikroarray

Material & Methoden Materialien DNA Extraktion GM Sojabohne (GTS 40-3-2) GM Mais (MON810, MON863, Bt176, Bt11, GA21, T25) DNA Extraktion Mittels CTAB Methode Herstellung passender Primer & Sonden Primer und Sonden müssen der spezifischen “Integrations-Junction- Sequenz“ entsprechen Primer müssen bestimmte Bedienungen erfüllen: Fähig sein degradierte genmoische DNA zu analysieren Schmelzpunkt zwischen 55 und 60°C Kompatibilität mit der PCR-Mischung

Konstruktion von Oligonukleotid -Mikroarrays Figure 1 Oligonucleotide microarray format. The red spots mean positive control. The black ones mean probes of the special junction site sequences. The blue ones mean probes of some ordinary promoter and terminator and positive control. The green ones mean blank control.

Material & Methoden PCR & Markierung Amplifizierung und Markierung der Zielgene in einem Multiplex-PCR System Direkte Sequenzierungs-Analyse der PCR-Produkte Die PCR-Produkte wurden mit einem PCR-Produkt-Aufreinigungs Kit aufgereinigt. Alle PCR-Produkte wurden direkt sequenziert mittels eines DNA- Sequenzer, um die Gültigkeit dieser amplifizierten PCR-Produkte zu bestärken. Hybridisierung & Signal Detektion

Verwendete Proben Zu testeten Proben Kontroll-Proben Blank von Nukleotiden (Wasserkontrolle) Positive Qualitätskontrolle (bekannte GMO Proben) Negative Qualitätskontrolle (konventionelle Proben)

Resultate Abbildung der Mikroarray- Hybridisierung

Resultate Bestimmung von positive und negative Ergebnisse Positive bzw. negative Ergebnisse beruhen auf der Erscheinung von Fluoreszenzsignalen von markierten Proben Die durchschnittliche Signalintensität von den negativen Qualitätskontrollproben wurde als Hintergrundsignalintensität verwendet Das Verhältnis zwischen der Signalintensität von den markierten Sequenzproben und den negativen Kontrollproben wurde berechnet Mehrere Experimente wurde mit bekannte positive und negative Proben durchgeführt. Ein Verhältnis von 5:1 wurde als Grenze für die positiven Resultate gesetzt.

Ein Verhältnis von 3.5:1 wurde als Grenze für negative Resultate gesetzt. Eine Probe wurde als positiv betrachtet, wenn der Durchschnitt über 5 war und als negativ wenn er unter 3.5 war. Jedes Experiment wurde 3 mal durchgeführt

Resultate Optimierung und Auswertung der Methode Das System besteht aus zwei Schritten: Multiplex- PCR Hybridisierung Die markierte Sequenz wurde amplifiziert Die Intensität des Fluoreszenzsignals wurde bestimmt Es ist wichtig alle Reaktionsschritte zu optimieren, um die Richtigkeit des Detektionsystem sicher zu stellen.

Diskussion PCR ist die am meisten verwendete Technik für GMO Detektion Problem: Es ist schwer PCR-Produkte mit konventionelle Methoden zu untersuchen, wenn mehrere Fragmente gleichzeitig amplifiziert werden müssen. Problemlösung: Oligonukleotid- Mikroarray Technologie schnell, zuverlässig und empfindlich Diskussion

Qualität des Papers Zusammenhang schwer ersichtlich Zu wenig Bilder und Kommentare Tabellen/ Abbildungen zum Teil mangelhaft erklärt Interessante und wichtige Methode