Mikroskopisch genaue Zellbestrahlung an S.N.A.K.E. • • • • Supraleitendes Nanoskop für angewandte kernphysikalische Experimente V. Hable, A. Hauptner, G. Dollinger, R. Krücken, P. Reichart Physik-Department E12, Technische Universität München A.A. Friedl Strahlenbiologisches Institut, LMU-München G.A. Drexler Institut für Molekulare Strahlenbiologie, GSF T. Cremer, S. Dietzel Department Biologie II, LMU-München

Versuchsaufbau und -ablauf Biologische Experimente Gliederung Allgemeines Ziel Versuchsaufbau und -ablauf Biologische Experimente

S • N • A • K • E Ziel

Anforderungen Um Größenordnungen variierbarer Schaden

Die beiden wichtigsten DNA-Schäden • N • A • K • E Die beiden wichtigsten DNA-Schäden Einzelstrangbrüche (SSB) Doppelstrangbrüche (DSB)

S • N • A • K • E 55 MeV 12C 296 keV/µm 17 DSB

Anforderungen Um Größenordnungen variierbarer Schaden Breites Ionenspektrum (H, He, … , Au) am Münchner Tandembeschleuniger Auf Submikrometer fokussierte Einzelionen Einzelionenpräparation am Rasterionenmikroskop SNAKE

Einzelionenpräparation S • N • A • K • E Einzelionenpräparation

S • N • A • K • E

Testbestrahlung eines Kernspurdetektors • N • A • K • E Erzielte Auflösung Testbestrahlung eines Kernspurdetektors

Zellbehälter

Bestrahlungseinrichtung

Muster in Zellen Blau: DAPI-gefärbte Zellkerne Grün: FITC-gefärbtes Rad51, das nach Bestrahlung mit 100MeV 16O zu den induzierten DSBs wandert

DNA-Reparatur durch homologe Rekombination S • N • A • K • E DNA-Reparatur durch homologe Rekombination

DNA-Reparatur durch homologe Rekombination S • N • A • K • E DNA-Reparatur durch homologe Rekombination Nach Trennung : Untersuchung der räumlichen und zeitlichen Dynamik von Rad51

Aufbereitung der bestrahlten Proben • N • A • K • E Inkubationszeit, in der Reparaturmechanismen anlaufen Fixierung der Zellen und Zugabe primärer und angefärbter sekundärer Antikörper DAPI-Gegenfärbung der DNA Mikroskopie

Fluoreszenzmikroskopie • N • A • K • E Fluoreszenzmikroskopie

3D-Mikroskopie Tiefenschärfe deutlich unter 1µm  Der Zellkern kann in seiner Tiefe nicht mit einem Bild erfasst werden  Aufnahme von Stacks in z-Richtung möglich γ-H2AX H2AX: Histon, um das die DNA gewickelt ist Phosphoriliert bei DSB Evtl. Signalfunktion Erscheint praktisch sofort nach Ionenbeschuss, daher sehr gut als Kontrolle geeignet

Fokusebene unterhalb des Punktes Dekonvolution Unschärfe aus „out of focus“-Ebenen Bild des Punktes PSF des Mikroskops z Ebene des Punktes Fokusebene unterhalb des Punktes Das sichtbare Bild eines Objektes ist das Objekt gefaltet mit der PSF Verbesserung der Bildqualität durch Dekonvolution (= rechnerbasierte Entfaltung) oder konfokale Mikroskopie

Dekonvolution

Konfokale Laserscanningmikroskopie

Konfokale Laserscanningmikroskopie Auffällig: Spuren am Rand des Kerns am ausgeprägtesten  „Echte“ Biologie?

Interessante Reparaturproteine etc. Rad51 Wichtiges Reparaturprotein bei der homologen Rekombination Lebensnotwendig p53BP1 Erscheint sehr früh (< ½ Std. nach Bestrahlung) Leitet wahrscheinlich Reparaturprozesse ein ohne selbst daran beteiligt zu sein Mdc1 Wie p53BP1 sehr früh und wahrscheinlich nicht aktiv an der Reparatur beteiligt Leitet evtl. einen alternativen Reparaturweg ein γ-H2AX H2AX: Histon, um das die DNA gewickelt ist Phosphoriliert bei DSB Evtl. Signalfunktion

Zeitliche Dynamik der Foci sch14_3 und sch20_3(Volker) blau = DAPI rot = g-H2AX grün = 53BP1 1 h nach Bestrahlung 6 h nach Bestrahlung 24 h nach Bestrahlung Rückgang durch abgeschlossene Reparatur? oder Vereinigung von Foci zu Groß- Komplexen? oder Durchgang durch Mitose? Suche nach Korrelation zwischen chaotischen Mustern und Zellzyklus in der letzten Strahlzeit Versuch einer quantitativen Auswertung

p53BP1 und Mdc1 p53BP1 Erscheint sehr früh (< ½ Std. nach Bestrahlung) Leitet wahrscheinlich Reparaturprozesse ein ohne selbst daran beteiligt zu sein Mdc1 Wie p53BP1 sehr früh und wahrscheinlich nicht aktiv an der Reparatur beteiligt Leitet evtl. einen alternativen Reparaturweg ein

Untersuchung von Konkurrenzprozessen mittels Kreuzbestrahlungen Nach einer Zeit T: senkrechte Linien Zuerst: waagrechte Linien

Kreuzbestrahlungen (T=0) g-H2AX-foci (Cy3) 53BP1-foci (FITC) DAPI DAPI Vorbestrahlung ca. 10Gy, also ca. 350 DSB

Kreuzbestrahlung (T=1,5h) g-H2AX-foci (Cy3) 53BP1-foci (FITC) DAPI DAPI Fixierung jeweils nach ½ Std. Inkubationszeit

Mögliche Ursachen Zellen tot bzw. so weit geschädigt, dass kein weiterer Reparaturversuch erfolgt Das in der Zelle vorhandene BP1 ist an den Reparaturpunkten der 1. Bestrahlung gebunden  neue Strahlzeit mit Variation der Zeiten T, der Inkubationszeit und der Dosis der Erstbestrahlung sowie zusätzlicher Beobachtung von Mdc1

Kreuzbestrahlungen April/Mai Leider Probleme mit den Antikörpern, insb. Mdc1 Bei längeren Zwischenzeiten T (>2h) keine Konkurrenz beobachtbar  Effekt kann nicht auf Absterben der Zelle beruhen Bei längerer Inkubationszeit (>1h) keine Konkurrenz beobachtet

Kreuzbestrahlungen April/Mai p53BP1 (Cy5) γ-H2AX (Cy3) (T=“0“h, Inkubation 1h)

Kreuzbestrahlungen April/Mai γ-H2AX (Cy3) p53BP1 (Cy5) (T=“0“h, Inkubation 1h, Niederdosisvorbestrahlung ca. 1,5Gy)

Kreuzbestrahlungen April/Mai Vermutung: Prozesse spielen sich auf kürzerer Zeitskala ab als angenommen Langfristiges Ziel: Lebendzellbeobachtung direkt am Bestrahlungsplatz

Kreuzbestrahlungen April/Mai p53BP1 (Cy5) Mdc1 (Alexa488) γ-H2AX (Cy3) DAPI  alternativer Reparaturweg von Mdc1 konnte nicht verifiziert werden (T=“0“h, Inkubation 1h)

Gezielte Bestrahlung eines Zellkerns • N • A • K • E

Gezielte Bestrahlung eines Zellkerns Problem: Zellen danach schwer bis gar nicht zu finden Lösung: Bedruckte Zellfolie Aluminisierte Mylarfolie wird belichtet und geätzt Zweistellige Koordinaten im Abstand 300µm

Gezielte Bestrahlung eines Zellkerns

Gezielte Bestrahlung eines Zellkerns p53BP1 (Cy3) DAPI mit Fokus auf Zellebene DAPI mit Fokus auf Folie Merge

Zusammenfassung und Ausblick Versuchsaufbau steht und liefert erste Ergebnisse Methoden zu sinnvoller quantitativer Auswertung müssen gefunden werden Untersuchung der Konkurrenzprozesse noch nicht abgeschlossen Mit perfektionierter Zielbestrahlung einzelner Kerne und Lebendzellmikroskopie existieren zwei Langzeitziele, die eine Vorreiterstellung in der Untersuchen der Dynamik von Reparaturvorgängen ausbauen würden