DNA - Sequenzierstrategien Von Theresa Köhler

Was ist Sequenzieren? Bestimmen der Basensequenz eines DNA - oder RNA -Strangs Schlussfolgerung auf Aminosäuresequenz in einem Protein Identifikation von Genen und kleinsten Veränderungen im Genom  

Wozu braucht man Strategien? Genome sind zu groß, um in einem einzigen Schritt sequenziert werden zu können eine Sequenzierungsreaktion (‚read'): ca. 600 Nukleotide Genomgrößen: Escherichia coli: 4,64 Mb Saccharomyces cerevisiae: 12,1 Mb Arabidopsis thaliana: 125 Mb Homo sapiens: 3200 Mb Triticum aestivum: 17000Mb

Strategien Shot-Gun-Methode Chromosome Walking Clone Fingerprinting Nested Deletion Delta-Restriktionsklonierung

Shot-Gun-Methode Das Genom wird nach Zufallsprinzip in kurze Fragmente (1,6 – 2,0 kb) zerbrochen (Restriktionsendonukleasen, Ultraschall) Klonierung Sequenzierung Suche nach Überlappungen

Shot-Gun-Methode Vorteil: Nachteile: schnelle Analyse der Fragmente Ermittlung der Gesamtsequenz bedarf enormen Computeraufwand, um anhand von Überlappungen die Gesamtsequenz zu erhalten Sich wiederholende Sequenzen im Genom können falsch eingeordnet werden oder völlig übergangen Lücken können auftreten

Chromosome Walking Bekanntes DNA-Stück wird langsam mit Hilfe von Hybridisierungssonden erweitert Wahl eines beliebigen Klons aus der Bibliothek Markierung Verwendung als Sonde für alle anderen Klone in Bibliothek Suche nach Überlappungen erneute Markierung und Hybridisierung

Chromosome Walking Vorteile: Nachteil: Position und Laufrichtung der Sequenz sind jederzeit bekannt. Redundanz von 2 durch die zusätzliche Anbringung von Primern in Gegenrichtung, s.d. der komplementäre Sequenzstrang bestimmt werden kann Nachteil: Arbeitsaufwändig, da Sequenzdaten nur Schritt für Schritt erhalten werden können (bis 200 kb) Synthese eines neuen Primers für jede Reaktion

Clone Fingerprinting Nachweis von Sequenzelementen, die zwei Klonen gemeinsam sind Behandlung mit Restriktionsendonukleasen Suche nach Fragmenten gleicher Größe Vorteile: schneller Keine feste Ausgangsposition Nachteile: Hoher Arbeitsaufwand, Agarosegele nach gleichgroßen Fragmenten zu untersuchen

Clone Fingerprinting

Nested Deletion Behandlung mit Exonukleasen zur Verkürzung (Deletion) Probenentnahme in regelmäßigen Abständen Vorteil: Nur ein Standard-Primer wird benötigt Repetive Sequenzen werden nicht übersehen

Delta-Restriktionsklonierung Zerkleinerung des DNA - Fragment und GelAnalyse Verkürzung des Klons durch Kopplung mit bestimmten Enzymen Lage der Verkürzungen weist unter Verwendung von Standardprimern auf die Sequenz hin

Literatur S.B.Primose – Genomanalyse T.Strachan – Das menschliche Genom T.A.Brown – Genomes 2nd Edition