Gelelektrophorese von Proteinen SDS-PAGE, IEF, 2D Christina Himmler
Gliederung Was ist Gelelektrophorese? SDS-PAGE IEF 2D Vor- und Nachteile der dargestellten Methoden
Was ist Gelelektrophorese? geladene Teile (Proteine) wandern je nach Größe und Ladung in einem elektrischen Gleichstrom-Feld Zonenelektrophorese Verwendung eines oder mehrerer Puffer oder pH-Gradient Apparatur bestehend aus Trenneinheit (Kapillare, horizontale oder vertikale Kammern), Stromversorgung (500-5000V und 150-400mA) und Kühlvorrichtung
Was ist Gelelektrophorese? 1 Puffer 2 Puffer Aufteilung in Sammel- und Trenngel
Herstellung von Gelen zur Elektrophorese Gele aus Polyacrylamid oder Agarose Poymerisation von Acrylamid mit Bisacrylamid
Herstellung von Gelen zur Elektrophorese Porengröße abhängig von Totalacrylamidkonzentration T [%]=g Acrylamid +g Bis x100 / 100mL und Vernetzungsgrad („crosslinking“) C [%]=g Bis x100 / (g Acrylamid +g Bis) unter Luftabschluss polymerisieren Polymerisationseffekt abhängig von Temperatur, pH-Wert, T-Wert etc. Nachpolymerisation, daher einen Tag stehen lassen
Gelelektrophorese Vorteile: hohe Auflösung (ca. 1-800 kDa) Porengröße variabel chemisch inert und stabil durchsichtig, gut anzufärben leicht aufzubewahren Nachteile: Monomere des Acrylamids neurotoxisch und cancerogen Porengröße limitiert: nur bis 800 kDa basische Gele werden hydrolysiert, nur bedingt haltbar
SDS-PAGE Sodium(Natrium)dodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese anionisches Detergenz, überdeckt Eigenladung von Proteinen durch Erhitzen mit SDS-Überschuss: Auflösen der Quartär- und Tertiärstruktur reduzierende Thiolverbindung (β-Mercaptoethanol oder DDT) spaltet Schwefelbücken zwischen Cysteinen auf → einheitliche Stab- bzw. ellipsoide Form Verwendung von SDS-haltigem (0,1%), diskontinuierlichen Tris-HCl / Tris-Glycin-Puffersystem
Disk. SDS-PAGE Sodium(Natrium)dodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese einheitlich negativ Ladung, daher gleiche Wanderungsgeschwindigkeit Clˉ als Leit-Ion, Glycin als Folge-Ion
Disk. SDS-PAGE Sodium(Natrium)dodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese Auftrennung der Stapel im Trenngel nur nach Molekülgröße! Anfärben mit Coomassie-Brilliant-Blau oder Silbernitrat Kalibrierungskurve Bestimmung der Molekülmasse durch Vergleich mit Standardprotein
Disk. SDS-PAGE Sodium(Natrium)dodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese Vorteile: auch hydrophobe und denaturierte Proteine können aufgetrennt werden schnelle Trennung Wanderung in eine Richtung Trennung nach 1 Parameter: Molekulargewicht Nachteile: irreversibles Denaturieren der Proteine nicht kompatibel mit nicht-ionischen Detergenzien
IEF – Isoelektrische Fokussierung Wanderung der Proteine durch Gel mit pH-Gradient bis zum pI Stagnation am pI Konzentrierungseffekt wirkt Diffusion entgegen
IEF – Isoelektrische Fokussierung Herstellung von immobilisierten pH-Gradienten: Immobiline (Acrylamidderivate) werden in Gelmatrix einpolymerisiert, binden kovalent an Polyacrylamidnetzwerk R: Carboxygruppe oder tertiäre Aminogruppe schwache Säuren oder schwache Basen kontinuierliches Verändern des Immobilinmischungsverhältnisses während des Gießens
IEF – Isoelektrische Fokussierung Vorteile von Agarosegel: schnelle Trennung über 800 kDa ungiftig Vorteile von Polyacrylamidgel: kaum Hintergrund-färbung
IEF – Isoelektrische Fokussierung Vorteile: Endpunktmethode sehr genaue Trennung; erfasst Unterschiede in einer geladenen AS mit SDS-PAGE kombinierbar pI einfach zu ermitteln Nachteile: zeitaufwendig aufwendiges Anfärben Proteine können aggregieren, wandern nicht in das Gel ein
2D-Gelelektrophorese zweidimensionale Gelelektrophorese in zwei Schritten zuerst Auftrennung mittels IEF, anschließend SDS-PAGE elektrisches Feld um 90° gedreht
2D-Gelelektrophorese Vorteile: gute Auftrennung nach zwei Parametern ( pI und Molekülmasse) hohe Auflösung für alle Proteine universell einsetzbar schnell durchzuführen Nachteile: schwierige Durchführung Proteinverlust von IEF zu SDS-PAGE
Das war's, danke schön!