Signaltransduktion in der T-Zellaktivierung Reporter-Gen-Assay Molekulare Zellbiologie von Immunzellen Blockpraktikum SS 2008 Referenten: Felix Eppler, Sibylle Molt 10.07.08
Einleitung Phosphorylierung der der Tyrosinreste der ITAMs durch Src-Kinasen Rekrutierung der Syk-Kinase ZAP-70 Aktivierung von ZAP-70 durch Tyrosin-Phosphorylierung von Lck und Fyn Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008
Zap70 Tyrosinkinase Phosphoryliert die Adapterproteine SLP-76 und LAT (linker of T cell activation) Aktivierung der PL Cγ und Ras-Proteine Ausgelöste Signalkaskade aktiviert die Transkriptionsfaktoren AP-1, NF-AT und NFκB binden an die jeweiligen Erkennungssequenzen im IL-2 Promotor Induktion der Synthese des IL-2 IL-2 fördert die Proliferation und Differenzierung der T-Zelle
Cytohesin-1 Guaninnukleotid-Austauschfaktor (GEF) für kleine ADP-Ribosylierungsfaktoren Überwiegend in Zellen des hämatopoetischen System exprimiert Wurde als spezifischer Interaktionspartner der β2-Untereinheit (CD18) des Integrins LFA-1 identifiziert (Kolanus et al.)
Ziel des Versuchs Untersuchung des Einflusses von Zap70 und Cytohesin-1 auf den IL-2 Reporter und damit auf die T-Zellaktivierung Ist Cytohesin-1 an Signalkaskaden der T-Zellaktivierung beteiligt? Mutanten Zap70K- inaktive Mutante (dominant negativ) Zap70Y292F funktionserhöhende Mutante Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008
Dominant-negative Cytohesin-1 Sec-7 Mutante (Cytohesin-1 E157K) in Jurkat E6 T-Zellen unterbindet nicht nur den GDP/GTP-Austausch an ARF1, sondern auch die LFA-1-vermittelte Adhäsion an ICAM-1 Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008
IL-2 Reporter-Gen Assay Hinter der Promotor-Region wurde das IL-2 Gen durch eine Luciferase cDNA ersetzt Luciferaseexpression wird dadurch u.a. von den Transkriptionsfaktoren AP-1, NF-AT und NFκB kontrolliert Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008
Luciferase Assay System Luciferase spaltet das Substrat Luciferin in Anwesenheit von ATP zu Oxyluciferin Die emittierten Photonen können mit Hilfe eines Luminometers detektiert werden Aus: Windheim, M. Reporter-Gen Assay. Vortrag zum Blockpraktikum SS 2008
Versuchsdurchführung Elektroporation der LT-Zellen mit Marker (GFP), Reporter (IL2) und Test-DNA (Vektorkontrolle, Cytohesin1 wt, Cytohesin1 E157K, Zap70K-, ZAP70Y292F) Stimulation der Zellen für 6 Stunden mit Okt3 (α CD3ε) und PMA (Phorbolester) Überprüfung der Transfektionseffizienz Bestimmung der GFP-Expression der einzelnen Transfektionen im FACS Messung der Luciferase Aktivität (Luminometer) und Proteinkonzentration (mittels BCA) Excel Auswertung
Ergebnisse Als Beispiel: Transfektionseffizienz von Cytohesin-1 E157K ermittelt durch FACS-Analyse (27,66%)
Ergebnisse Vektorkontrolle 26,6% ZAP70 K- 19,9% ZAP70 Y292F 20,27% Transfektionseffizienz Proteinkonzentration (mg/ml) Luciferase Aktivität Vektorkontrolle 26,6% Stim (1): 0,739 Stim (2): 0,803 Us (1): 0,756 Us (2): 0,67 Stim (1): 210213 Stim (2): 205821 Us (1): 979 Us (2): 1173 ZAP70 K- 19,9% Stim (1): 0,671 Stim (2): 0,87 Us (1): 0,692 Us (2): 0,823 Stim (1): 4553 Stim (2): 4442 Us (1): 516 Us (2): 691 ZAP70 Y292F 20,27% Stim (1): 0,633 Stim (2): 0,686 Us (1): 0,616 Us (2): 0,655 Stim (1): 44713 Stim (2): 51351 Us (1): 823 Us (2): 808 Cytohesin-1 wt 11,7% Stim (1): 0,857 Stim (2): 0,976 Us (1): 0,963 Us (2): 0,846 Stim (1): 59143 Stim (2): 53592 Us (1): 262 Us (2): 309 Cytohesin-1 E157K 27,66% Stim (1): 0,48 Stim (2): 0,88 Us (1): 0,634 Us (2): 0,783 Stim (1): 92826 Stim (2): 115140 Us (1): 1712 Us (2): 1770
Ergebnisse Ergebnisse entsprechen den Mittelwerten aus 2 Experimenten
Diskussion Vektorkontrolle stimuliert: IL2-Promotor wird sehr effizient aktiviert Vektor hat keinen Einfluss auf T-Zellaktivierung ZAP70 K- stimuliert: IL2-Promotor wird kaum aktiviert ZAP70 hat eine wichtige Funktion im Rahmen der T-Zellaktivierung
Diskussion ZAP70 Y292F stimuliert: schwache Aktivierung des IL2-Promotors Mutante scheint negative Einwirkung auf die T-Zellaktivierung zu haben Eine erhöhte Aktivierung des IL2-Promotors wäre zu erwarten gewesen (Zeitlmann et al., 1998) Müsste mit einem neuen Ansatz nochmals durchgeführt werden
Diskussion Cytohesin-1 E157K stimuliert: sehr schwache Aktivierung des IL2-Promotors Dominant negative Mutante scheint negativen Einfluss auf T-Zellaktivierung zu haben Cytohesin-1 wt stimuliert: sehr effiziente Aktivierung des IL2-Promotors leichte Steigerung gegenüber der Vektorkontrolle Cytohesin-1 scheint eine Rolle in der T-Zellaktivierung zu spielen