Aktuelles aus der Forschung betr. Immunologie Beda M. Stadler „Blut und Abwehr“ Spezialvorlesung 2004 Lernziele Einblick in die Forschung Vertiefung und Vernetzung Blockinhalt Was für eine Dissertation soll ich machen? Wie schreibt man ein Paper? Soll ich Forscher werden? Grundlagen vs angewandte Forschung?

Pocken als Forschungsprojekt Beobachtung Literatur Fragestellung Wahl der Methoden Finanzierung Forschungsplan Publikation Umsetzung Akkzeptanz http://www.jennermuseum.com/

Forschungsprojekt: Dissertation Beobachtung Literatur Fragestellung Wahl der Methoden Finanzierung Forschungsplan Publikation Umsetzung Akkzeptanz "Pure red-cell aplasia due to anti-erythropoietin antibodies"

Fallbeschreibung Dr. Gérald Keusch, Stadtspital Waid, Zürich Ein 1915 geborener Patient wurde im April 1998 wegen einer chronisch progredienten Niereninsuffizienz unserem nephrologischen Ambulatorium zugewiesen. Die Abklärungen (Normwerte in Klammern) ergaben eine chronische Niereninsuffizienz bei beidseitigen Schrumpfnieren unklarer Ätiologie, eine normochrome, normozytäre hyporegeneratorische Anämie: Hämoglobin 9,3 g/dl (12,3–15,8), Retikulozyten korrigiert 11‰ (5–18); einen sekundären Hyperparathyreoidismus: intaktes Parathormon 429 pg/ml (10–65) sowie eine leichte metabolische Azidose. Die Erythropoietinkonzentration im Serum war mit 27,9 U/ml (40–400) bei einem Hämatokrit von 28% (41–53) erniedrigt. Die Kreatinin-Clearance betrug 16 ml/min/1,73 m2 (70–120). Wegen weiterer Verschlechterung der Nierenfunktion wurde bei dem biologisch deutlich jüngeren Patienten im Juli 1998 eine chronische Hämodialysebehandlung eingeleitet. Bereits im April 1998 wurde wegen der renalen Anämie bei einem Hämoglobinwert von 9,3 g/dl (12,3–15,8) eine Behandlung mit Epoetin alpha (Eprex®) subkutan in einer Dosis von 10000 U (138 U/kg Körpergewicht) wöchentlich eingeleitet. Wegen eines Eisenmangels – Transferrinsättigung 8,5% (20–40), Ferritin 27,3 mg/l (10–330) – wurde gleichzeitig eine perorale Eisensubstitution begonnen. Unter dieser Therapie kam es innerhalb von 2 Monaten zu einem Anstieg des Hämoglobinwertes bis auf 13 g/dl. In den folgenden Monaten konnte unter Reduktion der Epoetindosis der Hämoglobinwert auf >11 g/dl eingestellt werden (Siehe nächste Folie). Dr. Gérald Keusch, Stadtspital Waid, Zürich

Klinischer Verlauf Hämoglobin (g/dl) Retikulozyten (%0) EPO Dosis (U/kg Körpergewicht/Woche)

Forschungsprojekt: Dissertation Beobachtung Literatur Fragestellung Wahl der Methoden Finanzierung Forschungsplan Publikation Umsetzung Akkzeptanz Übersichtsartikel EPO? PRCA? Autoimmunität? Originalarbeiten Methoden? In vitro/in vivo Modelle?

Literatur Schellekens H. Bioequivalence and the immunogenicity of biopharmaceuticals. Nat Rev Drug Discov2002; 1:457–462 Bergrem H, Danielson BG, Eckardt K-U, Kurtz A, Stridsberg M. A case of antierythropoietin antibodies following recombinant human erythropoietin treatment. In: Erythropoietin: Molecular Physiology and Clinical Application. Marcel Dekker, New York, NY,1993:266–275 Peces R, de la Torre M, Alcázar R, Urra JM. Antibodies against recombinant human erythropoietin in a patient with erythropoietin-resistant anemia. N Engl J Med1996; 335:523–524 Prabhakar SS, Muhlfelder T. Antibodies to recombinant human erythropoietin causing pure red cell aplasia. Clin Nephrol1997; 47:331–335 Casadevall N, Dupuy E, Molho-Sabatier P, Tobelem G, Varet B, Mayeux P. Autoantibodies against erythropoietin in a case with pure red-cell aplasia. N Engl J Med1996; 334:630–663 Casadevall N, Nataf J, Viron B et al. Pure red-cell aplasia and antierythropoietin antibodies in patients treated with recombinant erythropoietin. N Engl J Med2002; 346:469–475 Krantz SB. Pure red-cell aplasia. N Engl J Med1974; 291:345–350 Casadevall N. Antibodies against rHuEPO: native and recombinant. Nephrol Dial Transplant2002; 17 [Suppl 5]:42–47 Weber G, Gross J, Kromminga A, Loew HH, Eckardt K-U. Allergic skin and systemic reactions in a patient with pure red cell aplasia and anti-erythropoietin antibodies challenged with different epoetins. J Am Soc Nephrol2002; 13:2381–2383 Gershon SK, Luksenburg H, Cote TR, Braun MM. Pure red-cell aplasia and recombinant erythropoietin. N Engl J Med2002; 346:1584–1586 Krüger A, Schröer W, Röhrs F, Vescio G. PRCA in a patient treated with epoetin beta. Nephrol Dial Transplant2003; 18:1033–1034 Storring PL, Tiplady RJ, Gaines Das RE et al. Epoetin alfa and beta differ in their erythropoietin isoform compositions and biological properties. Br J Haematol1998; 100:79–89 Skibeli V, Nissen-Lie G, Torjesen P. Sugar profiling proves that human serum erythropoietin differs from recombinant human erythropoietin. Blood2001; 98:3626–3634 Cavill I, Williams JD. Benefits of recombinant human erythropoietin. Lancet2002; 360:1606–1607 etc...

Haematopoiese Erythropoietin (EPO) EPO EPO

Erythrozytenentwicklung Erythroblast Retikulozyt

Sauerstoff, EPO und die Niere

EPO Produktion peritubuläres Kapillarnetzwerk Interstitielle Zellen des peritubulären Kapillar- netzwerks der Niere produzieren EPO

Erythropoietin (EPO) EPO ist ein Zytokin, wird rekombinant hergestellt

Therapeutische Eiweisse

Anaemie Häufig assoziert mit schweren Nierenschäden Symtome: Müdigkeit, Atemnot und verminderte Mobilität Der primäre Defekt ist ein EPO Mangel Konservative Behandlung mit Eisen und Folsäure Blut Transfusionen bei schweren Anaemien (Risiko: Eisen Überdosierung, Infekte und Allosensibilisierung)

Pure Red Cell Aplasia (PRCA) sehr selten selektiver Defekt des Konochenmarks in der Erythrozyten Produktion Schwere Anaemie, weisse Blutzellen und Plättchen normal Zwei Typen congenital erworben

Gründe: erworbene PRCA Infektionen Thymoma Haematologische Malignien Solide Tumoren Nierenversagen Rheumatologische Krankheiten Schwerer Ernährungsmangel ABO-inkompatible Knochenmark Transplantation Schwangerschaft Idiopathisch Medikamente (EPO?) Antikörper gemeinsamer Nenner? 12

Antikörper gegen Zytokine? z.B. anti-Insulin Antikörper gegen natürliches und recombinantes Insulin “anti-insulin” in 95 hits

Antikörper & therap. Proteine 1/100,000 1/10,000 1/1,000 1/100 1/10 1/1 1/1,000,000 2 4 5 1 3 6 7 8 9 10 14 12 11 13 rHu-growth hormone rHu-erythropoietin sc rHu-TPA Bovine insulin Salmon calcitonin IFN alfa 2b Porcine insulin GM-CSF IFN beta 1a, 1b rHu-insulin rHu-factor VIII IL-2 Gonadotropin-releasing hormone IFN alfa 2a rHu=recombinant human

Forschungsprojekt: Dissertation Beobachtung Literatur Fragestellung Wahl der Methoden Finanzierung Forschungsplan Publikation Umsetzung Akkzeptanz Gibt es natürliche Antikörper gegen EPO?

Was verursacht eine PRCA? Immunisierung? Präexistierende natürliche anti-EPO Autoantikörper? existiert eine Autoimmunkrankheit? Induzieren Blutransfusionen eine PRCA? Moleculares Mimikry durch Xenoantigene?

Anti-EPO Antikörper EPO EPO Zucker oder Eiweiss? Spezifität und pathophysiologische Rolle?

Physiologische Rolle

Forschungsprojekt: Dissertation Beobachtung Literatur Fragestellung Wahl der Methoden Finanzierung Forschungsplan Publikation Umsetzung Akkzeptanz Hypothese ablehnen Negative Kontrolle Hypothese bestätigen Positive Kontrolle Laborausrüstung Geräte Know How Bewilligungen Tierversuche Einschlussverordnung

Antikörper Nachweis ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay farblos Enzym markierter Antikörper Substrat farbig Spez. Antikörper Antigen (EPO)

Affinitätschromatographie Antigen (EPO) Antiserum Salz Gel (Agarose) Spezifische Antikörper Serumbestandteile und ungebundene Antikörper

Neutralisierendes Epitop

Neutralisierende Antikörper Funktionelle Assays Neutralisierende Antikörper anti-EPO Antikörper EPO abhängige TF-1 Zellen mit EPO Rezeptor rhEPO Negative Kontrolle Positive Kontrolle Antikörper Test

Forschungsprojekt: Dissertation Ethik Wissensch. Freiheit Staatl. Förderung SNF CTI/KTI Inst. Budget Private Förderung Stiftungen Industrie Beobachtung Literatur Fragestellung Wahl der Methoden Finanzierung Forschungsplan Publikation Umsetzung Akkzeptanz

Wer bezahlt die Forschung?

Forschungsprojekt: Dissertation Methoden Etablierung Pilotexperimente Resultate go/no go Entscheide Beobachtung Literatur Fragestellung Wahl der Methoden Finanzierung Forschungsplan Publikation Umsetzung Akkzeptanz

Anti-EPO in normalen Seren 0.7 0.6 0.5 0.4 Anti-EPO Antikörper (ELISA) 0.3 0.2 0.1 0.0 Normal (n=17) SLE (n=22) Rheumatic (n=50) Allergic (n=21) Blut Spender

EPO Affinitätssäule EPO-Säule IVIG 330ml (11.2 g) 1.125 mg Elution (pH=2.75) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Fraction No. OD 280 1.125 mg EPO-Säule

Gereinigte anti-EPO Antikörper Fractionen Test im EPO ELISA Effluent der rhEPO-Säule Eluate der rhEPO- Säule 0.5 1 1.5 0.1 10 100 1000 Antikörper Konzentration mg/ml OD 450

Neutralisierende anti-EPO 0.8 EPO 0.1U/ml 0.7 GM-CSF 0.1ng/ml 0.6 0.5 Zellproliferation OD562-650 0.4 100% Hemmung 0.3 0.2 0.1 neg. Contr. pos. Contr. neutral. anti-EPO normaler Antikörper

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