für molekularbiologische Molekularbiologie Spezifische Hinweise für molekularbiologische Experimente

Gentechnikgesetz (GenTG) § Gentechnikgesetz (GenTG) Wird ein DNA-Fragment aus einem Organismus in einen anderen kloniert, so entsteht ein gentechnisch veränderter Organismus (GVO) Ein solches Experiment fällt unter das GenTG Veränderungen an Nukleinsäuren im Reagenzglas fallen nicht unter das GenTG § § GVO ist im englischen Sprachgebrauch „GMO“ : genetically modified organism §

S1-Labor Die Sicherheitsstufe „S1“ ist die geringst mögliche Einstufung Experimente dieser Sicherheitsstufe bedeuten „keine Gefahr für Mensch und Umwelt“ Bei einem S1-Experiment müssen bestimmte Vorschriften eingehalten werden Es existieren vier Sicherheitsstufen in einem S2: wird mit so genannten S2-Organismen gearbeitet (geringes Gefährdungspotential) höchste Stufe : S4 (Arbeiten mit hoch pathogenen Agenzien)

Kennzeichnungen Ein S1-Labor ist zu kennzeichnen In besonderen Fällen muss auch ein „Biogefährdungszeichen“ angebracht werden Versuche, die ein Biogefährungszeichen erforderlich machen, sind in Gymnasien verboten

Hinweise Arbeiten Sie mit monoseptischen Kulturen Vermeiden Sie Kontaminationen Ihrer Kulturen Nutzen Sie autoklavierte Gefäße und Lösungen Bakterienkontaminationen schleppen Nukleasen ein Monospetische Kultur: abgeleitet von einer Zelle (d.h. Sie arbeiten mit einem Klon) Autoklavierte Gefäße und Lösungen: Hitze-Inaktivierung der Nukleasen Nukleasen hydrolysieren unspezifisch Ihre Nukleinsäure-Präparationen

Vektor Viele Vektoren enthalten Gene, die für Antibiotika-Resistenzen kodieren (Selektionsgen) Hitzeinaktivieren Sie alle Lösungen, die das AB-Resistenzgen oder einen GVO enthalten könnten. Vektoren erleichtern Ihnen das Übertragen von DNA in Bakterienzellen (Klonierung). Vectoren bestehen aus wenigstens drei Genen: Selektionsgen: in der Regel ein Gen, das für eine Antibiotika-Resistenz kodiert (hier: bla=Amp= Ampicillin). Nach Gen-Dosis Effekt bewirkt eine höhere AB-Konzentration die Produktion mehrer hundert Vector-Kopien in einer einzelnen Bakterienzelle. Reportergen: enthält die MCS (multiple cloning site), die in einer kurzen Nukleotidsequenz viele Schnittstellen für Restriktionsenzyme enthält. In die MCS wird die Fremd-DNA einkloniert. Wird Fremd-DNA einkloniert, so wird das Genprodukt (hier -Galaktosidase kodiert durch das lacZ Gen) mutiert (Leserahmen-Mutation). Diese Mutation verhindert die Bildung eines blauen Produktes aus einem künstlichen Saccharid (X-Gal). Das rep Gen steuert die vom Bakterienchromosom unabhängige Replikation (Vermehrung) des Vectors Aus statistischen Gründen enthalten viele gebräuchliche Vektoren ein AB-Resistenzgen als Selektionsgen Hitzeinaktivierung (Autoklavieren) denaturiert die AB-Resistenz; damit wird einer möglichen Verbreitung der AB-Resistenz in der Natur vorgebeugt

Nukleinsäureanalyse Trennung der Nukleinsäuren durch Agarosegelelektrophorese Nachweis der Nukleinsäuren durch Färbungen Zum Nukleinsäure Nachweis werden empfindlichen Methoden genutzt. Neben Radioaktiven Verbindungen kommen fluoreszierende Chemikalien in Frage zwei Gebräuchliche Fluoreszenzfarbstoffe sind das interkalierende Ethidiumbromid und SYBR Green Farbstoffe Im Prinzip reagieren alle Farbstoffe mit DNA, die zu ihrem Nachweis genutzt werden. Sie sind daher mehr oder weniger toxisch (mutagen) Ethidium wird genutzt, weil es relativ billig ist; das weniger toxische SYBR Green ist teurer

DNA-Färbungen Nutzen Sie das weniger toxische SYBR Green Alle Reagenzien, die Nukleinsäuren nachweisen, müssen als toxische Verbindungen angesehen werden Nitrilhandschuhe benutzen Hautkontakte vermeiden Färbungen werden durch den Lehrer beaufsichtigt Färbungen sollte bevorzugt der Lehrer ausführen Ethidiumbromid (EtBr) ist preiswert Ähnlich empfindlich, aber weniger toxisch ist SYBR Green Separater, abgegrenzter Arbeitsplatz im Laborbereich

UV-Bank Ethidiumbromid gefärbte Agarosegele werden unter UV-Licht (<360 nm) betrachtet In DNA interkaliertes EtBr wird durch UV-Licht zur Fluoreszenz angeregt; das kann bei Klonierungsexperimenten zu Strahlenschäden an der DNA führen SYBR Green wird durch langwelliges Licht (>400 nm) zur Fluoreszenz angeregt. Es ist kein besonderer Arbeitsschutz (Augenschutz) erforderlich.

Entsorgungen Mit Bakterien oder mit AB-Resistenzgenen kontaminierte Gefäße: autoklavieren, dann waschen oder im Hausmüll entsorgen Pipettenspitzen sammeln: Bioabfall Objektträger etc. in Desinfektionslösung sammeln

Prüfliste Sicherheit Anregung zur Kontrolle des eigenen Arbeitsplatzes Betriebsanleitungen gelesen? Arbeitsplatz übersichtlich aufgeräumt? Chemikalien verstreut? Lösungsmittel stehen gelassen? Schläuche gerissen? Erste-Hilfe Kasten in Ordnung? Feuerlöscher? Not- und Augenduschen? Gase aus?

? The End Jetzt die Betriebsanleitung lesen! Verständnisfragen? Konkrete Sicherheitsmängel? Allgemeine Anregungen zur Verbesserung der Sicherheit im Praktikum? Bitte Unterschrift nicht vergessen! ? Wenn Sie als Lehrer Fragen haben, so melden Sie sich bitte bei: Dr. E. Stupperich (erhard.stupperich@biologie.uni-ulm.de oder unter Tel: 0731-50-22716) Weitere Anregung nehmen wir gerne entgegen! Diese Präsentation ist zu Ihrer Arbeitserleichterung erstellt worden. Wir haben sie nach bestem Wissen und Gewissen erstellt und von verschiedenen Fachkräften prüfen lassen. Dennoch können wir keine Gewähr für die juristische Richtigkeit unserer Aussagen übernehmen.

... und jetzt die Unterschrift bitte Ich bestätige durch meine Unterschrift, an der Sicherheitsunterweisung zum mikrobiologisch-molekularbiologischem Praktikum teilgenommen zu haben, die sich an die Betriebsanleitung anlehnt. Ich habe die Betriebsanleitung gelesen; ich hatte die Möglichkeit Fragen zu stellen; ich habe die Ausführungen verstanden und ich werde mich an die Anweisungen halten. Die Sicherheitsunterweisung fand am ..... von .... bis .... statt. Der Projektleiter ........................... Vorschlag für den Kopf einer Unterschriftenliste zur Sicherheitsunterweisung als Anhang sollte der Inhalt in Stichworten wiedergegeben werden. Dabei sollte erwähnt werden, die „Betriebsanweisung situationsgerecht“ besprochen zu haben Name Unterschrift

Anhang

www-Infoadressen 1 Gefährliche Stoffe: www.hvbg.de/d/bia/fac/fac.htm Allgemeine Gefahrstoffdatenbank: www.chemie.fu-berlin.de/chemistry/saftey/chemsafety.html Chemische Datenblätter: www.cdc.gov/niosh/ipcs/icstart.html www.chemdat.de (zu Verbindungen des Merck-vwr Katalogs) Leitfaden zum Einsatz gefährlicher Stoffe in Praktika: http://userpage.chemie.fu-berlin.de/˜tlehmann/krebs/intro.html Gesetze, Verordnungen zum Arbeits-und Umweltschutz: http:www.umwelt-online.de/recht

www-Infoadressen 2 Gentechnikgesetz: http://www.bba.de/gentech/gentg.htm http://www.bgchemie.de/ Gefahrstoffinformationen (Datenbank) und Informationen zur Biotechnologie

www-Infoadressen 3 www.chemdat.de : http://www.eusdb.de/ Sicherheitsdatenblätter für Verbindungsklasse wie Mineralsäuren, leichtbrennbare Flüssigkeiten. Zusätzlich finden Sie hier Angaben zu Medien für verschiedene Bakterien http://www.eusdb.de/ Sicherheitsdatenblätter verschiedener Lieferanten Betriebsanweisungen: http://www-organik.chemie.uni-wuerzburg.de/misc/betr_ein/betr_ein.html http://www.as.uni-erlangen.de/Gefahrstoffe/gefahrstoffe.htm