Rekombinante Herstellung von Insulin Großtechnischen Expression Luisa Riedel
Human Insulin zwei Polypeptiden: A-Kette- 21 und B-Kette- 30 AS Disulfidbrücken- zw. Cystein-Bausteinen und innerhalb A-Kette Sekundärstruktur: schraubenförmig, A-Kette zwei α-Helices, B-Kette wickelt ca. 40% zu α-Helix
Diabetes Diabetes-Typ-I Diabetes-Typ-II Keine Insulinsekretion aus den B-Zellen „Insulin-Resistenz“ Altersdiabetes
Gewinnung von Insulin Insulinherstellung aus Tierinsulin Chemische Synthese Gentechnische Herstellung
Gewinnung aus Tierinsulin
Chemische Synthese 223 Reaktionsschritte Keine industrielle Nutzung AS nacheinander verknüpft Nicht optimalen Schutzgruppenstrategien Entschützungsschritt: Na/NH3 (potenzieller Kettenbrüche, Entschwefelung Cysteinreste) Verbindung beiden Ketten zufällig maximal 1 - 2 % Ausbeute
Gentechnische Herstellung von Humaninsulin Expression der beiden Insulin-Ketten in unterschiedlichen E.coli Stämmen Expression von Proinsulin in E.coli Stämmen Anlehnung an Insulin-Biosynthese Primärprodukt = Prä-Proinsulin Expression von Mini-Proinsulin in Sacharomyces cerevisiae
Großtechnische Expression- E. coli Basisreinigung Hochreinigung
Verlauf der Fermentationsparameter Fusionsprotein- intrazellulär als unlöslicher Einschlusskörper Wachstumsphase: Fed-Batch- Betrieb Insulin Produktion chemisch induziert nach ca. 24 h Ernte
Insulin-Produktion mit Saccharomyces cerevisiae Fermentationsparameter während Startphase Stationäre Bedingungen nach ca. 72h erreicht Kultursuspension kontinuierlich aus Fermenter abgezogen kontinuierliche Betriebsweise ca. drei Wochen
Take Home Methode Verfahren Vorteile Nachteile Tier Insulin Aus Pankreas extrahiert Bis dahin Typ-1-Diabetes = Todesurteil Aufwendig, allergische Reaktionen Chemische Synthese Bildung vollsynthetisch Keine allergischen Reaktionen <200 Synthesestufe, Ausbeute gering Rekombinante (2 Ketten) Ketten Einbau + Synthese getrennt Gewinnung einfacher+ preiswerter, unbegrenzte, größere Menge, Keine Antikörperbildung, keine allergischen Reaktionen, Sehr geringe Gefahr von Infektionskrankheiten, Höhere Wirksamkeit (Schlüssel-Schloss-Prinzip zu 100% erfüllt) Rekombinante (1 Kette) Herstellung eines Fusionsproteins Rückfaltung (Prä-Proinsulin) Abspaltung der Prä-Sequenz Spaltung der Proteinkette Hefe Miniproinsulin: Signalsequenz Ausschleusung + enzymatische Spaltstelle sekretiert Insulin-Vorläufer -ersetzt Zellaufschluss Disulfidketten im Kultivierungsmedium korrekt geknüpft- Verzicht auf Faltungsschritt
Quellen Sahm, H., Antranikian, G., Stahmann, K.-P., & Takors, R. (2012). Industrielle Mikrobiologie. Springer Spektrum . Schüler, J. (2015). Die Biotechnologie-Industrie. Darmstadt : Springer Spektrum. http://u-helmich.de/bio/gen/reihe4/seite41.html https://www.youtube.com/watch?v=XWItPgftWsQ https://www.aerztezeitung.de/medizin/krankheiten/diabetes/article/945842/milliarden-bakterien-einsatz-insulin- diabetiker-produziert.html http://www.bioclips.de/content/01_biotech/insulin.html https://www.modernes-tierisches-insulin.de/insulinherstellung.html https://www.interpharma.ch/medikamente/1603-herstellung-von-medikamenten https://www.pharmazeutische-zeitung.de/ausgabe-372010/hormon-aus-bakterien-hefen-und-pflanzen/ https://www.deutsches-museum.de/fileadmin/Content/040_BN/PDFs/Prismentexte/Synthese_von_Insulin.pdf https://de.wikipedia.org/wiki/Geschichte_der_Diabetologie http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/8/bc/vlu/botenstoffe/hormone.vlu/Page/vsc/de/ch/8/bc/boten stoffe/hormone/insulinsynanim.vscml.html http://www.bernhardpeter.de/Heraldik/Apotheke/seite203.htm http://buster.zibmt.uni-ulm.de/dpv/dateien/alte%20Dokumente/ddg-downloads- teil1/Meissner_Insulin%20Biosynthese%20Sekretion.pdf