Zellorganellen am exocytotischen Weg (Translation, Ribosom, Nucleolus, endoplasmatisches Reticulum, Golgi-Apparat, vesiculärer Transport, Exocytose) Dr. Röhlich Pál prof. emeritus ÁOK 2012/2013, I. Semester: Grundlagen der Zellbiologie, 17. Sept. 2012

Translation (Proteinsynthese) Zweite, wichtige Stufe der Genexpression nach der Transkription: Verknüpfung der Aminosäuren gemäß der in der mRNA gespeicherten Information im Cytoplasma Mitteln: 1. mRNA Vom Gen auf RNA umgeschriebene Information für die Reihenfolge (Sequenz) der Aminosäuren. Kodonen, Startkodon: AUG, 3 Stopkodonen, eine Aminosäure kann von mehreren Kodonen kodiert sein, Anfangsstelle: 5’ Ende.  2. tRNA: wichtiges Adaptermolekül: an einem Ende ist die für sie charakteristische Aminosäure gebunden, das andere Ende bindet mit einem Basentriplet (Antikodon) das Kodon dieser Aminosäure an der mRNA. 3D Struktur Symbol   2D Struktur der tRNA: Klehblattstruktur

3.Ribosom „Arbeitstisch” der Proteinsynthese, besteht aus 2 molekularen Untereinheiten: große Untereinheit (3 RNA und 49 Proteine), kleinere Untereinheit (1 RNA und 33 Proteine). Die 2 Untereinheiten lagern sich am Anfang der Translation zusammen. Größe: 24 nm. Drei Bindungsstellen für tRNAs (A, P und E Stellen). Bindungsstelle für mRNA.   Polyribosom: an einem mRNA-Molekül arbeiten gleichzeitig mehrere Ribosomen („Perlenkette”) EM Aufnahme Der komplette Translationskomplex am Beginn der Translation  Sich wiederholender Zyklus der Verlängerung (Elongation) der Polypeptidkette: Die Anknüpfung einer Aminosäure an die Peptidkette besteht aus drei Schritten (Kodon-Erkennung, Ausbildung der Peptidbindung, Translokation 3 

Nucleolus   Bildung der Ribosomen: Basophiles Körperchen im Zellkern, färbt sich mit RNA-spezifischen Farbstoffen. „Ribosomen-Fabrik”: Stelle der Transkription von rRNA-Genen und des Zusammenbauens der ribosomalen Untereinheiten aus rRNA und Proteinen. Nucleolus im Zellkern einer Nervenzelle Bildung der Ribosomen: 5 Chromosomen in einem haploiden Chromosomensatz tragen rRNA Gene (in mehreren Kopien). Diese Stelle der Chromosomen heißt NOR (nucleolus organisator region). Die NOR Stellen der 10 Chromosomen sind im Nucleolus aneinder gerichtet. Die transkribierte RNA ist mit Hilfe von Enzymen in 3 Stücke geschnitten, eine weitere kleine rRNA stammt von einem anderen Chromosom. Ribosomale Proteine sind vom Cytoplasma durch Kernporen in den Kern transportiert und im Nucleolus mit den dort umgeschriebenen rRNA Molekülen zusammengebaut. Die entstandenen ribosomale Untereinheiten sind durch die Kernporen in das Cytoplasma hinaustransportiert.  Lichtmikroskopie granulärer Komponent (Ribonukleoprotein Partikeln) filamentärer Komponent (RNA Moleküle) Zahl der Nucleoli: meistens ein großer Nucleolus, am Anfang und Ende der Zellteilung können mehrere Nucleoli vorkommen (entsprechend der NOR-Regionen der Chromosomen) Mikroskopisches Zeichen einer intensiven Proteinsynthese: großer Nucleolus und basophiles Cytoplasma (wegen der vielen Ribosomen) EM Aufnahme 

Die Polypeptidkette nach der Translation Proteinsynthese am Ribosom Aufnahme der richtigen Raumstruktur in den meisten Fällen spontan während der Translation (die Aminosäuresequenz bestimmt die endgültige, tertiäre Struktur des Proteins!) oder mit Hilfe (Chaperone: große Proteinkomplexe mit einem inneren Raum helfen die richtige Raumstruktur aufzunehmen). Abbau falscher, nicht richtig gefalteter Proteine. Solche Proteine werden von Proteinkomplexen erkannt, mit Ubiquitin (kleine Proteine) markiert, und in großen proteolytischen Komplexen (Proteasomen) abgebaut. Chemische Modifikationen (posttranslationelle Modifikationen). Z.B. Anknüpfung von reaktiven Gruppen (z.B. OH-Gruppe), von kürzeren oder längeren Zuckerketten (Glykosylierung), Spaltung der Polypeptidkette an bestimmten Stellen (gezielte Proteolyse), … Sortierung der Proteine (targeting). Bedeutung. Lokalisationssignale (kurze Peptidabschnitte bestehend aus mehreren Aminosäuren), Receptorproteine, die das Signal in den Zielkompartimenten erkennen, Transportmechanismus. Proteinsynthese am Ribosom Cotranslations -transport Zellkern Protein-Sortierung spätes Endodom, bzw. Lysosom Zellmembran, extracellulärer Raum

Der Weg durch das endoplasmatische Reticulum und Golgi-Apparat Plasmamembran konstitutive Exocytose (Membran-Nachschub) geregelte Exocytose Sekretion konstitu Proteine: Exportproteine (sekretorische Pr.) Lysosomale Proteine Integrale Membranproteine ER-Golgi-residente Proteine trans-Golgi- Netzwerk Lysosom Golgi- Apparat  Kernhülle

Endoplasmatisches Reticulum (ER) Struktur: röhrchenförmige und sackartige Bauelemente (Tubuli bzw. Cisternen), die ein 3D anastomosierendes Netzwerk bilden. Diese Elemente bestehen aus Membran und aus dem von der Membran begrenzten inneren Raum. Das ER wurde von Porter und Palade in den 1950-er Jahren mit dem Elektronenmikroskop entdeckt. Zwei Formen: raues ER: (Ribosomen an der Membran) und glattes ER. EM Bild 

Raues ER (rER)  EM Bild EM Bild  Stark entwickelte Form Viele, parallel-angeordnete Cisternen: (auch Ergastoplasma genannt, Ausschnitt aus einer Bauchspeicheldrüsenzelle) Weniger entwickelte Form Netzwerk von wenigen Cisternen und Tubuli (Ausschnitt aus einer Lutein-Zelle)  EM Bild EM Bild 

Cotranslationstransport (vektorielle Translation) Was geschieht im rauen ER? Hauptfunktion: Proteinsynthese, Durchtritt durch die Membran und Modifizierung bestimmter Proteine Cotranslationstransport (vektorielle Translation) Beginn der Proteinsynthese am Ribosom, Abschnitt der ersten 15-35 Aminosäuren: Lokalisationssignal (Signalsequenz). Das Signal wird von einem Ribonukleoprotein Komplex (signal recognition particle: SRP) erkannt. SRP bindet an die Signalsequenz und blockiert die Translation. SRP funktioniert selbst als ein Signal, und wird an seinen Receptor (SRP-Receptor, ein integrales Membranprotein in der ER-Membran) gebunden. Damit ist der Ribosom-SRP Komplex an der ER-Membran verankert. SRP löst sich ab, die Translation ist fortgesetzt, die Peptidkette gleitet durch das Kanal in der ER-Membran durch. Das Ribosom ist an die ER-Membran gebunden. Am Ende der Translation schneidet ein Enzym (Signalpeptidase) die Signalsequenz ab, das Kanal fällt in einzelne Untereinheiten auseinander. Signal- Sequenz  1 Kanal 2 3 4

Am Ende des Cotranslationsstransportes: 1. Export- und lysosomale Proteine: die Peptidketten gleiten durch das Kanal der rER völlig durch und sind frei im ER Lumen  2. Integrale Membranproteine bleiben hängen in der ER-Membran, weil sie eine oder mehrere hydrophobe stop-transfer Signale besitzen.  Proteinmodifizierungen im rER Faltung, Qualitätskontrolle, Korrektion mit Chaperonen. Beginn der N-Glykosylierung (Anknüpfung von Mannose-reichen Zuckerketten) Anbindung von reaktiven OH-Gruppen (bei bestimmten Proteinen) Ausbildung von Disulfidbrücken

Zwei Nervenzellen aus einem Spinalganglion, Versilberung nach Aoyama Golgi-Apparat Der Golgi-Apparat kann mit speziellen Methoden lichtmikroskopisch nachgewiesen werden. Entdeckung und erste Beschreibung: Camillo Golgi (1843-1926), konnte in 1898 mit einer Versilberungstechnik in Nervenzellen ein Netzwerk nachweisen („apparato reticolare interno”). Nobel-Preis1906. Für eine lange Periode hat man diese Struktur als Kunstprodukt gehalten.  Netzwerk Dictyosom Zwei Nervenzellen aus einem Spinalganglion, Versilberung nach Aoyama Lichtmikroskopische Darstellung: mit Versilberung, mit langer Osmiumfixierung, oder mit Immuncytochemie Lokalisation: meistens in der Nähe des Zellkerns. Individuelle Baukomponenten: Dictyosomen.  Immuncytochemischer Nachweis des Golgi-Apparates an einer gezüchteten Bindegewebszelle mit Antikörper gegen ein residentes Golgi-Protein.

Elektronenmikroskopisches Bild des Golgi-Apparates Kondensierungsvakuol trans-Golgi Netzwerk (TGN)  rER cis-Cisterne trans-Cisterne cis-Golgi Netzwerk Golgi-Vesikeln 

Was geschieht im Golgi-Apparat? Sortierung: rER Proteine zurück, die anderen vorwarts. Mannose-Phosphorylierung der lysosomalen Proteine (Signal Man-6-P) rER vesikulärer Transport rER → Golgi Abspalten überflüßiger Mannosen cis Seite  cis-Golgi Netzwerk Anbindung von Acetylglukosamin cis-Cisterne mediale Cisterne Anbindung von Galaktose und Sialsäure Synthese von Glykosaminoglykanen trans-Cisterne trans-Golgi Netzwerk (TGN) trans Seite Ankopplung von Sulfatgruppen, Sortierung lysosomale Proteine Exportproteine Membranproteine Richtung Plasmamembran Richtung Lysosom Glykosylierung (terminaler Abschnitt der N-Glykosylierung, O-Glykosylierung: Glycocalyx, Glykoproteine, Glykolipide, Mucine), Synthese von Glykosaminoglykanen, Proteoglykane :extracelluläre Matrix

Sortierung vom trans-Golgi Netz Exocytose: Öffnen eines Vesikels oder Vakuols an der Zellmembran durch Fusion der zwei Membranen. Bedeutung. Sortierung vom trans-Golgi Netz Richtung Plasmamembran A. Membranproteine Transport dieser Proteine mit den vom trans-Golgi Netz abgeschnürten Vesikeln. Läuft kontinuierlich, die Vesikeln öffnen sich an der Plasmamembran mit Exocytose. B. Export- oder Sekretionsproteine. Sekrethaltige Vesikeln oder Vakuolen (größer) schnüren sich vom trans-Golgi Netz ab, öffnen sich mit Exocytose an der Plasmamenbran mit Exocytose, ihr Inhalt ist freigesetzt. Geregelte Exocytose: Exocytose nur an äussere Signale (Signalübertragung). zB. Mastzelle. Konstitutive Exocytose: kontinuierlich, ohne spezifische Signale. Plasmamembran geregelte Exocytose (Sekretion) konstitutive Exocytose (Membrannachschub) trans-Golgi Netzwerk Lysosom Golgi Kompllex 2. Richtung Lysosom (bzw. dessen frühe Form, das späte Endosom) Lysosome Proteine. Lokalisationssignal: Mannose-6-Phosphat, Transportreceptoren: Man-6-P-Receptoren rER  Kernhülle

Fusionsstelle zwischen Vesikelmembran und Plasmamembran Exocytose in einer sezernierenden Zelle (Mastzelle) Fusionsstelle zwischen Vesikelmembran und Plasmamembran   Sequentielle Exocytose: von aussen nach innen öffnen sich die sekretorischen Vesikeln ineinander. Exocytose von zwei sekretorischen Vesikeln

Kapiteln in Lehrbüchern: Quellen der verwendeten Illustrationen: Lüllman-Rauch: Histologie, Kapiteln 5.1, 5.2 Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, 3. Auflage, Kapiteln 7.2, 15.2, 15.3, 15.4, Quellen der verwendeten Illustrationen:  Röhlich: Szövettan, 3. Auflage, Semmelweis Verlag, Budapest  Alberts – Johnson – Lewis – Raff – Roberts – Walter: Molecular biology of the cell. 5. Auflage, Garland Science  Röhlich: eigene Präparate und/oder Aufnahmen, bzw. Zeichnungen  Campbell – Reece: Biologie, Spektrum - Fischer