Translation Grundlagen der Zellulären Biochemie

Präsentation zum Thema: "Translation Grundlagen der Zellulären Biochemie"—  Präsentation transkript:

1 Translation Grundlagen der Zellulären Biochemie
Institut für biophysikalische Chemie Labor für Strukturanalyse Heike Pöpperl, PhD Grundlagen der Zellulären Biochemie Vorlesung zum Modul BCB P07 im Bachelor-Studiengang Biochemie Hannover Translation

2 Translation Ribosomen mRNA Bakterium Translationsfaktoren, GTP
Aminoacyl-tRNAs „beladene tRNAs“ Aminoacyl-tRNA-Synthetasen Aminosäuren, ATP Unterteilt in: Initiation Elongation Termination Eukaryot Bakterium

3 Bestandteile der Ribosomen
Bakterien Größe 70S Kleine UE 30S 16S rRNA Große UE 50S - 23S rRNA 5S rRNA E.coli Eukaryoten Größe 80S Kleine UE 40S 18S rRNA Große UE 60S - 28S rRNA 5.8S rRNA 5 S rRNA

4 Translation: Initiation
Bildung eines Initiationskomplexes aus Ribosom, mRNA und Start-tRNA, gebunden an das AUG-Startcodon an der P-Stelle. E P A M AUG 5‘ 3‘

5 Translation: Elongation
Bindung einer passenden Aminoacyl-tRNA an der A-Stelle. Knüpfung einer Peptidbindung und damit Übertragung des Peptidylrests auf den Aminoacylrest. E P A AUGAAAUCC 5‘ 3‘ M M K

6 Translation: Elongation
Bindung einer passenden Aminoacyl-tRNA an der A-Stelle. Knüpfung einer Peptidbindung und damit Übertragung des Peptidylrests auf den Aminoacylrest. Verlagerung der Peptidyl-tRNA von der A- zur P-Stelle und der mRNA um ein Codon: Translokation Synthese des Polypeptids: vom Amino (N)-Terminus zum Carboxy (C)-Terminus (leicht zu merken: Aminosäure). mRNA: gelesen von 5‘ nach 3‘. Elongationsfaktoren E. coli Elongationsfaktoren Eukaryoten EF-Tu eEF1A EF-Ts eEF1B EF-G eEF2 E P A E P A M K AUGAAAUCC 5‘ 3‘

7 Translation: Elongation
Initiationsfaktoren E. coli Initiationsfaktoren Eukaryoten EF-Tu eEF1A EF-Ts eEF1B EF-G eEF2 Die Elongation verläuft bei Bakterien und Eukaryoten sehr ähnlich. Die Elongationsfaktoren haben analoge Aufgaben: EF-Tu und eEF1A: G-Proteine, binden Aminoacyl-tRNA EF-Ts und eEF1B: GEFs für EF-Tu und eEF1A, sorgen für den GDP/GTP-Austausch EF-G und eEF2: Translokation unter GTP-Verbrauch

8 Elongation Bakterien: Bindung der Aminoacyl-tRNA
Bindung einer passenden Aminoacyl-tRNA mit EF-Tu/GTP an der A-Stelle. (Aminoacyl-tRNA auf der E-Stelle dissoziiert) E P A CAUAAA 5‘ 3‘ H M K S G D L EF-Tu GTP K EF-Tu GTP K

9 Elongation Bakterien: Bindung der Aminoacyl-tRNA
Bindung einer passenden Aminoacyl-tRNA mit EF-Tu/GTP an der A-Stelle. (Aminoacyl-tRNA auf der E-Stelle dissoziiert) Korrekte Bindung aktiviert GTP-Hydrolyse GTP Hydrolyse: EF-Tu/GTP EF-Tu/GDP + Pi Dissoziation von EF-Tu/GDP Proofreading E P A CAUAAA 5‘ 3‘ H K S G D L M EF-Tu GTP GDP Pi K EF-Tu GTP K

10 Animation E. coli Ribosom tRNA-mRNA Wechselwirkung: Basenpaarung zwischen mRNA und den tRNAs an der A und P-Stelle.

11 Elongation Bakterien: Bindung der Aminoacyl-tRNA
Codon-Anticodon-Erkennung in der A-Stelle CV CV Codon: ‘UUU3‘ Anticodon: 3‘AAG5‘ Codonposition Watson-Crick-Paarung 2. Codonposition Watson-Crick-Paarung 3. Codonposition Stabilisierung der Codon-Anticodon-Interaktion durch die kleine UE (16S rRNA): Konformation der Watson-Crick BP wird erkannt CV CV CV

12 Elongation Bakterien: Wirkungsweise von Paromomycin
Fehllesung der Codons Paromomycin bewirkt eine Konformation von A1492 und A 1493 wie bei der Stabilisierung der Codon-Anticodon-Interaktion. Fehllesung der Codons.

13 Elongation Bakterien: Bindung der Aminoacyl-tRNA
EF-Tu verhindert die vollständige Lokalisierung der tRNA in der A-Stelle der großen UE. Erst nach GTP-Hydrolyse durch EF-Tu und dessen Dissoziation bindet die tRNA auch in der A-Stelle der 50S UE und hat Zugang zum Peptidyltransferase Zentrum (PTC). Das Antibioikum Tetracyclin verhindert diesen Schritt und die tRNA wird freigesetzt. Die Umorientierung der tRNA stellt auch einen Proofreading-Kontrollschritt dar: Eine unpassende Aminoacyl-tRNA wird freigesetzt. 50S 30S

14 Elongation Bakterien: Knüpfung der Peptidbindung
M H K S G D L M H K S G D L E P A CAUAAA 5‘ 3‘ K

15 Peptidyltransferase Elongation Bakterien: Knüpfung der Peptidbindung
Animation Elongation Bakterien: Knüpfung der Peptidbindung Peptidyltransferase Katalysiert die zentrale Reaktion der Proteinsynthese. Keine zusätzliche Energie nötig. Das katalytische Zentrum liegt in der großen ribosomalen UE. Das katalytische Zentrum wird von der rRNA gebildet. Das Ribosom ist ein Ribozym. Eindeutig gezeigt durch Röntgenstrukturanalyse von Thomas Steitz und Peter Moore.

16 Elongation Bakterien: Knüpfung der Peptidbindung
Peptidytransferase-Reaktion: Nukleophiler Angriff der alpha Aminogruppe (deprotoniert) der Aminoacyl-tRNA (A-Stelle) auf das C-Atom der Carbonylgruppe der Peptidyl-tRNA (P-Stelle).

17 Elongation Bakterien: Knüpfung der Peptidbindung
Peptidytransferase-Reaktion: Der nukleophile Angriff der alpha Aminogruppe auf das Carbonyl-C wird durch die günstige Positionierung der Aminogruppe und der Carbonylgruppe durch rRNA ermöglicht. Stabilisierung des Überganszustands. Durch Ausschluss von H2O wird eine Hydrolyse der Peptidyl-tRNA verhindert.

18 Elongation Bakterien: Translokation
Translokation: Verschiebung der tRNAs und der mRNA durch Bindung von EF-G und GTP-Hydrolyse Unbeladene tRNA von der P-Stelle auf die E-Stelle Peptidyl-tRNA von der A-Stelle auf die P-Stelle dabei Verschiebung der mRNA um ein Codon EF-G/GTP EF-G/GDP + Pi M H K S G D L E P A E P A GDP Pi K EF-G GTP CAUAAAUAG 5‘ 3‘

19 Elongation Bakterien: Translokation
EF-G vervollständigt die Umlagerung der tRNAs auf der 30S UE 50S 30S spontane Verlagerung der tRNAs auf der 50S UE

20 Elongation: EF-Tu und EF-G
Phe-tRNAPhe, Hefe EF-Tu/GMPPNP, Thermus aquaticus EF-G/GMPPNP, T. thermophilus

21 Elongation: EF-Tu; regulatorisches G-Protein
Animation GTP GDP

22 Elongation: EF-Ts; GEF für EF-Tu
GDP EF-Ts GDP GTP EF-Tu GTP EF-Ts verringert die Affinität für GDP, indem es die Bindung von Mg2+ in der Nukleotidbindungsstelle stört

23 Translation: Termination
Freisetzung des Peptids durch Hydrolyse der Esterbindung zwischen Peptid und tRNA. Ähnlich bei Bakterien und Eukaryoten. K M H S G D L Freisetzungsfaktoren Bakterien RF-1: UAA und UAG Stoppcodons RF-2: UAA und UGA Stoppcodons RF-3 : Freisetzung von RF-1/RF-2 RRF: Dissoziation der ribosomalen UEs Freisetzungsfaktoren Eukaryoten eRF1: alle Stoppcodons eRF3: Freisetzung von eRF1 eIF3 ist an der Dissoziation des Ribosoms beteiligt K M H S G D L E P A CAUAAAUAG 5‘ 3‘

24 Termination in Bakterien
Bindung eines Stoppcodons durch Freisetzungsfaktoren RF-1 oder RF-2; Stoppcodon wird durch ein Tripeptid erkannt. K M H S G D L -COO- Der Freisetzungsfaktor ermöglicht das Eindringen von Wasser in das Peptidyltransferasezentrum. K M H S G D L Freisetzung des Peptids durch Hydrolyse der Esterbindung zwischen Peptid und tRNA. E P A H2O -OH RF-1 CAUAAAUAG 5‘ 3‘

25 Termination in Bakterien
Hydrolyse der Peptidyl-tRNA Esterbindung

26 Termination in Bakterien: Bindung von RF-1 an der A-Stelle

27 Termination in Bakterien
Dissoziation von RF-1 wird durch das G-Protein RF-3 beschleunigt. Bindung von RF-3/GDP an das Ribosom bewirkt GDP/GTP Austausch. RF-3/GTP verdrängt RF-1. GTP-Hydrolyse setzt RF-3 frei. Pi E P A GTP GDP RF-3 RF-1 CAUAAAUAG 5‘ 3‘

28 Termination in Bakterien
RRF und EF-G/GTP binden. GTP-Hydrolyse verschiebt RRF auf die P-Stelle, was die tRNAs auf der P- und der E-Stelle freisetzt. Das Ribosom zerfällt in die beiden UEs, was durch IF-3-Bindung erleichtert wird. Kein RRF in Eukaryoten, andere Proteine beteiligt, eIF3-Bindung ist wichtig für die Dissoziation. E P A Pi E P A GDP GTP EF-G RRF RRF CAUAAAUAG 5‘ 3‘ IF-3

29 RRF

30 Cotranslationaler Einbau von Selenocystein
Die tRNASec hat einen eigenen Elongationsfaktor SelB, der sie auf dem Ribosom an einem Stoppcodon UGA einbaut. Selenocystein wird nur dann eingebaut, wenn die mRNA einen Erkennungshairpin ausbildet. Der bildet sich in Prokaryonten kurz hinter dem UGA. In Eukaryonten liegt er aber hinter der codierenden Sequenz im 3´-untranslatierten Bereich. Eukaryonten Prokaryonten

31 Inhibitoren der Translation
Animation Inhibitor Organismus Wirkungsweise Initiation Streptomycin Prok Verhindert die Initiation Elongation Tetracyclin Prok Inhibiert Aminoacyl-tRNA Bindung Paromomycin Prok Fehllesung der Codons Streptomycin Prok Fehllesung der Codons Chloramphenicol Prok Bindet 50S, blockiert Peptidyltransferase Cycloheximid Euk Inhibiert Translokation der Peptidyl-tRNA Diphteria toxin Euk Inaktviert eEF2 durch ADP-Ribosylierung Vorzeitige Termination Puromycin Prok Aminoacyl-tRNA Analogon Euk Wirkt als Peptidylakzeptor Verhindert Peptidverlängerung. Ribosomeninaktivation Ricin Euk Katalytische Inaktivierung der S rRNA durch Depurinierung.

32 Ribosomeninaktivierung durch Rizin/Ricin
Aus Ricinus communis Eine der tödlichsten bekannten Substanzen Glykoprotein, das aus 30 kDa Untereinheiten besteht, die durch Disulfidbrücken verbunden sind B-Untereinheit ist ein Lektin (Proteine, die spezifisch an Glykoproteine und Glykolipide binden) und bindet an die Zelloberfläche. Endocytose und Disulfidreduktion setzen die A-Untereinheit frei. Ricin A greift spezifisch ein einzelnes hochkonserviertes Adenosin an Position 4324 in der eukaryontischen 28S RNA an (wichtig für die Elongation). Die N-Glycosidaseaktivtät der A-Untereinheit entfernt die Adeninbase. Entfernung dieser Base (ohne die RNA Kette zu spalten) inaktiviert die große Untereinheit des Ribosoms. Ein Ricinmolekül kann 50,000 Ribosomen inaktivieren: Absterben der Zellen! Gegenmittel unbekannt. Regenschirmattentat Georgi Markov, ein bulgarischer Dissident und regiemekritiker, wurde 1978 in London von einem Agenten des bulgarischen Geheimdienstes getötet. Eine mit Rizin gefüllte Kugel gelangte durch eine Stich mit einer Regenschirmspitze in seine Wade. Er starb drei Tage später.

33 Lokalisierung von Proteinen
Alle Proteine werden von Ribosomen synthetisiert. Die Information über den Bestimmungsort der Proteine ist in ihrer Aminosäuresequenz codiert. Wichtige Mechanismen Cotranslationaler Transport von intraluminalen und extrazellulären Proteinen in das Lumen des ER. Cotranslationale Lokalisierung von integralen Membranproteinen in der ER-Membran. Synthese und Transport von mitochondrialen Proteinen. Transport von Proteinen in den Zellkern.

34 Lokalisierung von Proteinen
Die cotranslationale Lokalisierung von intraluminalen und extrazellulären Proteinen, sowie die Synthese der meisten integralen Membranproteine erfolgt am rauen ER.

35 Lokalisierung von Proteinen
Nach der Synthese am rauen ER, erfolgt die weitere Verteilung der Proteine durch Vesikeltransport, zB ER-Goli-Apparat-Plasmamembran/extrazellulärer Bereich. Die Erkennungssequenz KDEL hält Proteine im ER zurück. Die Mannose-6-Phosphat-Modifizierung bewirkt eine Lokalisierung im Lysosom Fast alle Proteine werden im ER und Golgi-Apparat glykosyliert, d.h. es werden Zucker angeknüpft.

36 mRNA Die Signalhypothese
“Dr. Guenter Blobel at New York's Rockefeller University won the Nobel Prize in medicine Monday (October, 1999) for discovering how proteins find their rightful places in cells ………..” Die Signalhypothese Blobel und Sabatini (1971): Schlagen vor, dass der Ort der Synthese (freie Ribosomen oder raues ER) durch Informationen festgelegt wird, die sich im N-Terminus des Proteins befinden. Nachgewiesen 1975 von Blobel und Dobberstein. mRNA Signal peptide N

37 Proteinsynthese am rauen ER: Intraluminale Proteine
Die Bindung von Ribosomen an das ER wird cotranslational über eine hydrophobe Signalsequenz am N-Terminus des synthetisierten Proteins vermittelt. Das SRP (signal recognition particle) bindet an die hydrophobe Signalsequenz und an das Ribosom und stoppt die Translation. SRP bindet an den SRP-Rezeptor (SR) im Komplex mit dem Translokon, einem Proteinkanal in der ER-Membran. Das Ribosom bindet an das Translokon. GTP-Hydrolyse setzt SRP und SR frei. Die Proteinsynthese wird fortgesetzt. Das neu synthetisierte Protein wird durch das Translokon in das Lumen des ERs geleitet. Das Signalpeptid wird durch die Signalpeptidase abgespalten. Im ER finden die Faltung, mit Hilfe von Chaperonen und Glykosylierung des Proteins statt. Disulfidbrücken werden ausgebildet. Signalpeptide:

38 Cotranslationaler Transport von Proteinen durch
die ER Membran 1. N-terminales Signalpeptid Signal Erkennungspartikel cytosolischer Rezeptor

39 Cotranslationaler Transport von Proteinen durch
die ER Membran 1. N-terminales Signalpeptid Signal Erkennungspartikel cytosolischer Rezeptor 3. SRP Membranrezeptor

40 Cotranslationaler Transport von Proteinen durch
die ER Membran 1. N-terminales Signalpeptid Signal Erkennungspartikel cytosolischer Rezeptor 3. SRP Membranrezeptor

41 Cotranslationaler Transport von Proteinen durch
die ER Membran 1. N-terminales Signalpeptid 4. Translokationskanal Signal Erkennungspartikel cytosolischer Rezeptor 3. SRP Membranrezeptor

42 Cotranslationaler Transport von Proteinen durch
die ER Membran 1. N-terminales Signalpeptid 4. Translokationskanal Signal Erkennungspartikel cytosolischer Rezeptor 5. Nukleotidhydrolyse 3. SRP Membranrezeptor

43 Cotranslationaler Transport von Proteinen durch
die ER Membran 1. N-terminales Signalpeptid 4. Translokationskanal Signal Erkennungspartikel cytosolischer Rezeptor 5. Nukleotidhydrolyse 6. Signalpeptidase 3. SRP Membranrezeptor

44 Cotranslationaler Transport von Proteinen durch
die ER Membran 1. N-terminales Signalpeptid 4. Translokationskanal Signal Erkennungspartikel cytosolischer Rezeptor 5. Nukleotidhydrolyse 6. Signalpeptidase 3. SRP Membranrezeptor 7. ER-Chaperon

45 Signalerkennungspartikel
SRP ist ein Riboprotein SRP-Bindung blockiert die Bindungsstelle für Elongationsfaktoren SRP 7S RNA

46 Translokon (SEC61) von der Seite von oben
seitliche Öffnung des Translokons TM-Helix von oben Peptidkette

47 Proteinsynthese am rauen ER: Integrale Membranproteine
Typ I: Abspaltbares N-terminales Signalpeptid, eine Transmembranregion. Ortientierung: N-Terminus im ER, C-Terminus im Cytosol. Ähnlicher Mechanismus mit SRP und SR wie bei den intraluminalen Proteinen. Die Aminosäuresequenz enthält eine hydrophobe Transmembransequenz (TM, Stop transfer sequenz, Helix). Diese wird vom Translokon durch eine seitliche Öffnung in die Membran entlassen. (Typ-Einteilung ist nicht einheitlich. Diese wird ua im Voet,Voet, Biochemistry 4th Edition benutzt)

48 Proteinsynthese am rauen ER: Integrale Membranproteine
Typ II und Typ III: Kein Signalpeptid, keine Spaltung. Eine Transmembranregion, die vom SRP erkannt wird. TYP II: N-Terminus im Cytosol, C-Terminus im ER. Typ III: N-Terminus im ER, C-Terminus im Cytosol (wie bei Typ I). Die hydrophobe TM wird vom Translokon durch eine seitliche Öffnung in die ER-Membran entlassen.

49 Proteinsynthese am rauen ER: Integrale Membranproteine
Typ IV: Mehrere Transmembransequenzen. mögliche Orientierungen

50 Synthese und Transport von mitochondrialen
Proteinen Mitochondriale Proteine werden zum Großteil von Genen im Zellkern codiert. Die Proteine werden im Cytosol synthetisiert, in einer ungefalteten Form von Chaperonen stabilisiert und posttranslational ins Mitochondrium eingeschleust. Dafür gibt es verschiedene Translokasen: TOM: Translocase of the mitochondrium outer membrane TIM: Translocase of the mitochondrium inner membrane und assoziierte Tom und Tim Proteine Zielorte für Proteine: Intermembranraum, Matrix, innere Membran, äußere Membran Intermembranraum Matrix innere Membran äußere Membran

51 Synthese und Transport von mitochondrialen Proteinen
Alle Proteine passieren das TOM40-Translokon in der äußeren Membran. Matrixproteine mit einer positiv geladenen N-terminalen Signalsequenz (wird in der Matrix abgespalten) binden zunächst an Tom20, passieren Tom40, werden an TIM23 weitergeleitet und in die Marix bzw die innere Membran gebracht. Die positive Ladung der Signalsequenz und das starke Transmembranpotential helfen dabei. Proteine mit interner Zielerkennung (TM) binden an Tom70, passieren Tom40, werden von Tim9/10 übernommen und entweder an das TIM22-Translokon weitergeleitet, das Proteine in die innere Membran einbaut oder an den SAM-Komplex, der Proteine in die äußere Membran einbaut. Manche Proteine der inneren Membran werde erst in die Matrix importiert und dann durch Oxa1 in die innere Membran gebracht. Oxa1 wird auch von Proteinen genutzt, die im Mitochondrium syntetisiert werden. Bei Proteinen des Intermembranraums wird ein Weitertransport durch die innere Membran zB durch Fehlen einer Signalsequenz oder Faltung im Innermembranraum verhindert.

52 Import von Proteinen in den Zellkern
Kernproteine werden im Cytosol synthetisiert, gefaltet und dann durch Kernporen in den Kern transportiert. Die Proteine tragen ein NLS (Kernlokalisationssignal, nuclear localisation signal), das positiv geladene Aminosäuren enthält. Dies wird im Cytosol von Importin gebunden und das Protein in den Zellkern importiert. Dort liegt Ran in der GTP-Form vor, löst Importin ab und bringt es zurück ins Cytosol, wo es sein GTP spaltet und Importin frei lässt. Struktur einer Kernpore

53 Nukleärer Porenkomplex
Aufsicht: Seitenansicht: