Zellorganellen am exocytotischen Weg rER, Sortierung der Proteine, Golgi-Apparat, vesiculärer Transport, Exocytose) Dr. Pál Röhlich prof. emeritus ÁOK 2016/2017, I. Semester, 19. Sept. 2016

Die zwei Schritte der Genexpression Transkription Translation (Proteinsynthese) DNA Peptidkette mRNA Ribosom Gen mRNA Cytoplasma Zellkern Die zwei Schritte der Genexpression

Die Polypeptidkette nach der Translation Proteinsynthese am Ribosom Aufnahme der richtigen Raumstruktur in den meisten Fällen spontan während der Translation (die Aminosäuresequenz bestimmt die endgültige, tertiäre Struktur des Proteins!) oder mit Hilfe (Chaperone: große Proteinkomplexe mit einem inneren Raum helfen die richtige Raumstruktur aufzunehmen). Abbau falscher, nicht richtig gefalteter Proteine. Solche Proteine werden erkannt, mit Ubiquitin (kleine Proteine) markiert, und in großen proteolytischen Komplexen (Proteasomen) abgebaut. Chemische Modifikationen (posttranslationelle Modifikationen). Z.B. Anknüpfung von reaktiven Gruppen (z.B. OH-Gruppe), von kürzeren oder längeren Zuckerketten (Glykosylierung), Spaltung der Polypeptidkette an bestimmten Stellen (gezielte Proteolyse), … Sortierung der Proteine (targeting). Bedeutung. Lokalisationssignale (kurze Peptidabschnitte bestehend aus mehreren Aminosäuren), Receptorproteine, die das Signal in den Zielkompartimenten erkennen, Transportmechanismus. Proteinsynthese am Ribosom Cotranslations -transport Zellkern Protein-Sortierung spätes Endodom, bzw. Lysosom Zellmembran, extracellulärer Raum

Der Weg durch das endoplasmatische Reticulum und Golgi-Apparat Plasmamembran konstitutive Exocytose (Membran-Nachschub) geregelte Exocytose Sekretion konstitu Proteine: Exportproteine (sekretorische Pr.) Lysosomale Proteine Integrale Membranproteine ER-Golgi-residente Proteine trans-Golgi- Netzwerk Lysosom Golgi- Apparat  Kernhülle

Endoplasmatisches Reticulum (ER) Struktur: röhrchenförmige und sackartige Bauelemente (Tubuli bzw. Cisternen), die ein 3D anastomosierendes Netzwerk bilden. Diese Elemente bestehen aus Membran und aus dem von der Membran begrenzten inneren Raum. Das ER wurde von Porter und Palade in den 1950-er Jahren mit dem Elektronenmikroskop entdeckt. Zwei Formen: raues ER: (Ribosomen an der Membran) und glattes ER. EM Bild 

Raues endoplasmatisches Retikulum (rER) Weniger entwickelte Form Netzwerk von wenigen Cisternen und Tubuli (Ausschnitt aus einer Lutein-Zelle) Stark entwickelte Form Viele, parallel-angeordnete Cisternen: (auch Ergastoplasma genannt, Ausschnitt aus einer Bauchspeicheldrüsenzelle)  EM Bild EM Bild 

Cotranslationstransport (vektorielle Translation) Was geschieht im rauen ER? Hauptfunktion: Synthese und Transmembrantransport bestimmter Proteine, Proteinmodifizierung Cotranslationstransport (vektorielle Translation) Beginn der Proteinsynthese am Ribosom, Abschnitt der ersten 15-35 Aminosäuren: Lokalisationssignal (Signalsequenz). Das Signal wird von einem Ribonukleoprotein Komplex (signal recognition particle: SRP) erkannt. SRP bindet an die Signalsequenz und blockiert die Translation. SRP funktioniert selbst als ein Signal, und wird an seinen Receptor (SRP-Receptor, ein integrales Membranprotein in der ER-Membran) gebunden. Damit ist der Ribosom-SRP Komplex an der ER-Membran verankert. SRP löst sich ab, die Translation ist fortgesetzt, die Peptidkette gleitet durch das Kanal in der ER-Membran durch. Das Ribosom ist an die ER-Membran gebunden. Am Ende der Translation schneidet ein Enzym (Signalpeptidase) die Signalsequenz ab, das Kanal fällt in einzelne Untereinheiten auseinander. Signal- Sequenz  1 Kanal 2 3 4

Am Ende des Cotranslationsstransportes: 1. Export- und lysosomale Proteine: die Peptidketten gleiten durch das Kanal der rER völlig durch und sind frei im ER Lumen  2. Transmembranproteine bleiben hängen in der ER-Membran, weil sie eine oder mehrere hydrophobe stop-transfer Signale besitzen. 

Proteinmodifizierungen im rER Faltung, Qualitätskontrolle, Korrektion mit Chaperonen. Beginn der N-Glykosylierung (Anknüpfung von Mannose-reichen Zuckerketten an Asparagin Seitenketten) Anbindung von reaktiven OH-Gruppen (bei bestimmten Proteinen) Ausbildung von Disulfidbrücken

Zwei Nervenzellen aus einem Spinalganglion, Versilberung nach Aoyama Golgi-Apparat Der Golgi-Apparat kann mit speziellen Methoden lichtmikroskopisch nachgewiesen werden. Entdeckung und erste Beschreibung: Camillo Golgi (1843-1926), konnte in 1898 mit einer Versilberungstechnik in Nervenzellen ein Netzwerk nachweisen („apparato reticolare interno”). Nobel-Preis1906. Für eine lange Periode hat man diese Struktur als Kunstprodukt gehalten.  Netzwerk Dictyosom Zwei Nervenzellen aus einem Spinalganglion, Versilberung nach Aoyama Lichtmikroskopische Darstellung: mit Versilberung, mit langer Osmiumfixierung, oder mit Immuncytochemie Lokalisation: meistens in der Nähe des Zellkerns. Individuelle Baukomponenten: Dictyosomen.  Immuncytochemischer Nachweis des Golgi-Apparates an einer gezüchteten Bindegewebszelle mit Antikörper gegen ein residentes Golgi-Protein.

Elektronenmikroskopisches Bild des Golgi-Apparates Kondensierungsvakuol trans-Golgi Netzwerk (TGN)  rER cis-Cisterne trans-Cisterne cis-Golgi Netzwerk Golgi-Vesikeln 

Was geschieht im Golgi-Apparat? Sortierung: rER Proteine zurück, die anderen vorwarts. Mannose-Phosphorylierung der lysosomalen Proteine (Signal Man-6-P) rER vesikulärer Transport rER → Golgi Abspalten überflüßiger Mannosen cis Seite  cis-Golgi Netzwerk Anbindung von Acetylglukosamin cis-Cisterne mediale Cisterne Anbindung von Galaktose und Sialsäure Synthese von Glykosaminoglykanen trans-Cisterne trans-Golgi Netzwerk (TGN) trans Seite Ankopplung von Sulfatgruppen, Sortierung lysosomale Proteine Exportproteine Membranproteine Richtung Lysosom Richtung Plasmamembran Glykosylierung (terminaler Abschnitt der N-Glykosylierung, O-Glykosylierung: Glycocalyx, Glykoproteine, Glykolipide, Mucine), Synthese von Glykosaminoglykanen, Proteoglykanen :extracelluläre Matrix

Vesiculärer Transport Transport von Substanzen zwischen membranbegrenzten Kompartimenten. Bedeutung. Abschnüring des Vesikels Transport Fusion des Vesikels Donorkompartiment Zielkompartiment Aufgaben zu lösen: Selektivität: nur bestimmte Substanzen dürfen überführt werden, Sortierung Spezifität: darf nur mit der Membran des Zielkompartiments fusionieren molekulare Identität des Donorkompartiments darf nicht geändert werden Substanzen überführt ins Zielkompartiment: ein Stück Membran (mit Membranproteinen) und gelöste Substanzen im Lumen des Vesikels. 1. Die Knospung des Vesikels in das Cytosol, Ausbildung der Hülle Zwei Funktionen der Hülle: 1. Ansammlung von Proteinen zu transportien, und 2. Krümmung der Membran zur Bildung eines Vesikels Die clathrin-Hülle: Baustein: triskelion, bildet korbähnilche Struktur um den Vesikel (Pentagons und Hexagons). Zwischen clathrin und Receptor ist ein Adapterprotein die Verbindung. Adapter Transport- Receptor Clathrin Abschnürung mit Dynamin triskelion clathrin „Korb” Die Knospung des Vesikels und das Einfangen der transportierenden Moleküle mit der clathrin-Hülle 

Die COP-Hülle ist aus mehreren Proteinuntereinheiten (Coatomeren) aufgebaut. Die Ausbildung der Hülle beginnt mit der Verankerung aktivierter G-Proteine (sar1 bzw. Arf) in die Membran, diese sammeln die verschiedenen Coatomere um sich. Die Membran beginnt zu krümmen, die Coatomere mit ihren Bindungsstellen sortieren die Proteine zum Transport. Die COPI- und COPII Hüllen bauen sich nach ähnlichen Prinzipien auf, aber binden verschiedene Proteine für den Transport und transportieren in anderen Richtungen. Untereinheiten der COP II Hülle 2. Wanderung des Vesikels. Die Hülle löst sich ab, der Vesikel ist in kleinerer Distanz mit einfacher Diffusion, bei längeren Strecken mit Hilfe von Motorproteinen entlang cytoskeletaler Strukturen Richtung Zielkompartiment bewegt. residentes ER Protein  3. Die Verankerung des Vesikels an der Membran des Zielkompartiments und Fusion. Die Zielmembran wird mit einem molekularen Erkennungsmechanismus erkannt. Rab Proteine (kleine G-Proteine) in der Vesikelmembran eines bestimmten Kompartiments markieren die Identität des Vesikels und andere Proteine in der Membran des Zielkompartiments (rab-Effektoren) sorgen für die spezifische Bindung. Bei der Erkennung spielen weitere Proteine wichtige Rollen: Die Fusion: zwei faserige integrale Proteine, eins in der Membran des Vesikels (v-SNARE) und das andere in der Membran des Zielkompartiments (t-SNARE) binden sich mit ihren fadenartigen Teilen aneinder und ziehen die zwei Membranen zusammen. Wassermoleküle werden dadurch vom Zwischenraum der Membranen ausgeschlossen, die zwei Lipiddoppelschichten lagern sich eng aneinander, die Lipide sind umorganisiert, und die Trennwand bricht durch. Nach der Membranfusion sind v- und t-SNAREs voneinander durch ein NSF Protein getrennt.  Regelung der Fusion zB. bei der Exocytose von synaptischen Vesikeln in Nervenendigungen: durch Entfernung eines hemmenden Proteins.

Hüllen an verschieden Transportwegen spätes Endosom rER Plasma- membran  Zwei Modellen des Transportes im Golgi-Apparat  Schieben der Cisternen vorwärts: an der cis-Seite sind Cisternen neugebildet, an der trans-Seite löst sich die Cisterne in Vesikeln auf Vesiculärer Transport zwischen den Cisternen

Sortierung vom trans-Golgi Netz Exocytose: Öffnen eines Vesikels oder Vakuols an der Zellmembran durch Fusion der zwei Membranen. Bedeutung. Sortierung vom trans-Golgi Netz Richtung Plasmamembran A. Membranproteine Transport dieser Proteine mit den vom trans-Golgi Netz abgeschnürten Vesikeln. Läuft kontinuierlich, die Vesikeln öffnen sich an der Plasmamembran mit Exocytose. B. Export- oder Sekretionsproteine. Sekrethaltige Vesikeln oder Vakuolen (größer) schnüren sich vom trans-Golgi Netz ab, öffnen sich mit Exocytose an der Plasmamenbran mit Exocytose, ihr Inhalt ist freigesetzt. Geregelte Exocytose: Exocytose nur an äussere Signale (Signalübertragung). zB. Mastzelle. Konstitutive Exocytose: kontinuierlich, ohne spezifische Signale. Plasmamembran geregelte Exocytose (Sekretion) konstitutive Exocytose (Membrannachschub) trans-Golgi Netzwerk Lysosom Golgi Kompllex 2. Richtung Lysosom (bzw. dessen frühe Form, das späte Endosom) Lysosome Proteine. Lokalisationssignal: Mannose-6-Phosphat, Transportreceptoren: Man-6-P-Receptoren rER  Kernhülle

Fusionsstelle zwischen Vesikelmembran und Plasmamembran Exocytose in einer sezernierenden Zelle (Mastzelle) Fusionsstelle zwischen Vesikelmembran und Plasmamembran   Sequentielle Exocytose: von aussen nach innen öffnen sich die sekretorischen Vesikeln ineinander. Exocytose von zwei sekretorischen Vesikeln

Membran Nachschub mit Exocytose Receptorabhängige Pinocytose mit Clathrin-Hülle- Freisetzung des Sekretes mit konstitutiver Exocytose Zellmembran Freisetzung des Sekretes mit geregelter Exocytose Receptor- und Membran-Recirkulation an die Zellmembran Frühes Endosom Spätes Endosom Sekretorisches Granul Trans-Golgi Netzwerk Lxsosomale Enzyme transportierendes Vesikel Retrogader Transport mit COP I Vesikel Cis-Golgi Netzwerk Tubulovesiculäre Strukturen Nackte Vesikel Vesikelabschnürung mit COPII Hülle Rauhes ER

Kapiteln in Lehrbüchern: Quellen der verwendeten Illustrationen: Lüllman-Rauch: Histologie, Kapiteln 5.1, 5.2 Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, 3. Auflage, Kapiteln 7.2, 15.2, 15.3, 15.4, Quellen der verwendeten Illustrationen:  Röhlich: Szövettan, 3. Auflage, Semmelweis Verlag, Budapest  Alberts – Johnson – Lewis – Raff – Roberts – Walter: Molecular biology of the cell. 5. Auflage, Garland Science  Röhlich: eigene Präparate und/oder Aufnahmen, bzw. Zeichnungen  Campbell – Reece: Biologie, Spektrum - Fischer