Klinisch nicht signifikantes PCR-Resultat aus Liquor Am Beispiel von Fall Nummer 7783335 Herleitungen von Thomas Krech und André Burnens

Klinisch nicht signifikantes PCR-Resultat aus Liquor Kasuistik GG, männlich, 82 j. Befund im Liquor: ca. 50 Kopien/ml VZV -DNA keine Zellen Patient mit Nervus olfactorius – Problematik. Ohne Meningitis- oder Enzephalitis – Zeichen. Verlauf: Unauffällig unter Aciclovir

Erklärungsmöglichkeiten Klinisch nicht signifikantes PCR-Resultat aus Liquor Erklärungsmöglichkeiten Kontamination : Diverse Hinweise in Literatur von präanalytischer Kontamination. Virus im Liquor im Rahmen einer niederschwelligen VZ-Virämie (bei Reaktivierung?): In Literatur keine Hinweise. Lokale Virusproduktion im ZNS ohne Entzündungs-zeichen bei inerter Abwehrlage (Alter?): In Literatur keine Hinweise.

Klinisch nicht signifikantes PCR-Resultat aus Liquor Kontamination Präanalytisch in der Klinik: Medizin-Personal to sample, Kreuzkontamination von anderem Patienten. Präanalytisch im Labor: Sample to sample/ positive Control to sample. Analytisch: bei Real-Time-PCR unwahrscheinlich, da geschlossener Prozess.

Präanalytische Kontamination Klinisch nicht signifikantes PCR-Resultat aus Liquor Präanalytische Kontamination Grundlagen: Virusgrösse VZV: 100-200 nm (1/10 Bakteriendurchmesser) Im Vergleich: Bakterienvolumen E.coli: ca. 1 fL (1000 aL) entsprechend etwa 500 Viren in einem E.coli. DNA – Gehalt : Liquor: 50 Kopien/ml bis 108 Kopien/ml Bläschen: ca. 109 Kopien/ml (keine Literatur) Nachweisgrenze: 103 Virus-DNA Kopien/ml entsprechend 5 Kopien/5 µl Probeninokulation (Poster Krech et al.) Bei Aufkonzentrierung während Extraktionsprozess entsprechend niedriger. Max. Virusvolumen: 4.203E-18 =4,2 attoL

Präanalytische Kontamination Klinisch nicht signifikantes PCR-Resultat aus Liquor Präanalytische Kontamination Grundlagen: Tropfengrösse Aerosol: 0.1 – 100 µm, im Mittel 0.5-5 µm Tröpfchenvolumen: 1 Tropfen = 50 µl, ein kleiner Tropfen= 1 ul Durchmesser 2 µ entspricht etwa 4 µ3 = 4 x 10 -15 L = 4 f (femto)L = 4 x 10 -9 µL Volumen einer Kugel mit Radius r: V = (4/3) r3 π Tröpfchendurchmesser: Beispiele: Durchmesser Radius Volumen Volumen flüssig 2 1 mm 4 mm3 µL µm µ3 fL 1.26 0.63

Präanalytische Kontamination Klinisch nicht signifikantes PCR-Resultat aus Liquor Präanalytische Kontamination Grundlagen: Volumen- und Durchmesser - Berechnungen

Präanalytische Kontamination Klinisch nicht signifikantes PCR-Resultat aus Liquor Präanalytische Kontamination Niesen, Husten: Bis 40’000 Tröpfchen, enthaltend insgesamt etwa 108 Viren Schwebende bis mehrere Kilometer weit (wenn ca. 0.5 µm) Bis 200 km/h

Präanalytische Kontamination Klinisch nicht signifikantes PCR-Resultat aus Liquor Präanalytische Kontamination Fragen: In welchem Volumen Liquor mit 108 VZV-DNA-Kopien/ml ist 1 DNA – Kopie enthalten? Wie gross ist der Tropfen, der 1 DNA-Kopie enthält ?

Präanalytische Kontamination Klinisch nicht signifikantes PCR-Resultat aus Liquor Präanalytische Kontamination Antworten: In welchem Volumen Liquor mit 108 VZV-DNA-Kopien/ml ist 1 DNA – Kopie enthalten? in 10 pL (0.01 µL= 10-11 L) Wie gross ist der Tropfen, der 1 DNA-Kopie enthält ? 10 pL entsprechen einem kugelförmigen Tropfen von 27 µ Durchmesser

Präanalytische Kontamination Klinisch nicht signifikantes PCR-Resultat aus Liquor Präanalytische Kontamination Bläschen statt Liquor: Bei mit Viren (200 nm Durchmesser) dicht gepackten Bläschen sind rein rechnerisch statt 1 DNA-Kopie 25 Kopien enthalten. Also lassen sich gut 10x mehr DNA-Kopien enthaltende Viren in ein Bläschen packen als im Liquor vorhanden sind. Somit reicht 1 pL zur Kontamination aus.

Präanalytische Kontamination Klinisch nicht signifikantes PCR-Resultat aus Liquor Oder anders ausgedrückt: Wäre mein Reaktions-Röhrchen von 100 µl = 10-4 L Volumen, das mit 1 pL Bläschcheninhalt kontaminert wurde, eine Badewanne von 100L (Faktor 106), dann reichten 1 ml eines Bläschcheninhalts aus, um eine positive Reaktion zu erhalten (oder eine Flasche von 1 L Schnaps in einem Swimming-Pool von 10x4x2.25 m entsprechend 100’000 Liter). Dies bei einer Nachweisgrenze von lediglich 1000 Kopien/ml. Bei der in unserem Fall angenommenen Nachweisgrenze von 10 Kopien/ml reichen 100 x weniger für eine Kontamination, also ein Schnapsglas im Pool !

Präanalytische Kontamination Klinisch nicht signifikantes PCR-Resultat aus Liquor Präanalytische Kontamination Referenzen: CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Jan. 2006, p. 165–256 Vol. 19, No. 1 0893-8512/06/$08.000 doi:10.1128/CMR.19.1.165–256.2006 Copyright © 2006, American Society for Microbiology. All Rights Reserved. Real-Time PCR in Clinical Microbiology: Applications for Routine Laboratory Testing M. J. Espy,* J. R. Uhl, L. M. Sloan, S. P. Buckwalter, M. F. Jones, E. A. Vetter, J. D. C. Yao, N. L. Wengenack, J. E. Rosenblatt, F. R. Cockerill III, and T. F. Smith Medical Microbiology and Immunology Volume 194, Numbers 1-2, 7-12, DOI: 10.1007/s00430-003-0202-1 Original Investigation Quantitative real time PCR detection of Varicella-zoster virus DNA in cerebrospinal fluid in patients with neurological disease Stephan W. Aberle, Judith H. Aberle, Christoph Steininger und Elisabeth Puchhammer-Stöckl