von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger 30.03.2017 Nachweis von Calciumdipicolinat in Bacillus subtilis Endosporen mittels energiedispersiver Röntgenbeugung von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger

Übersicht Motivation Messapparatur Auswertung 30.03.2017 Übersicht Motivation Messapparatur Aufbau Optimierung der Einstellungen Durchführung der Messungen Auswertung Normierung der Messdaten Faltung der Messdaten Korngrößenabhängigkeit Zusammenfassung & Ausblick Quellen PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger

Übersicht Motivation Einschub: Energiedispersive Röntgenbeugung 30.03.2017 Übersicht Motivation Einschub: Energiedispersive Röntgenbeugung Messapparatur Aufbau Optimierung: Simulation Messung Auswertung Normierung Faltung Korngröße Zusammenfassung & Ausblick Quellen PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger

Motivation – Bacillus subtilis 30.03.2017 Motivation – Bacillus subtilis Bakterium „Bacillus subtilis“ ist Endosporenbildner Endosporen Ähnlichkeit zu Bacillus anthracis Clostridium botulinum Clostridium tetani Große Mengen von kristallinem Ca-DPA im „Core“ Rest besteht aus nicht- kristallinen Proteinen, DNA, etc… -Anthrax Botulismus Tetanus -15% des Trockengewichts! -Vorteile EDX PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 4

Motivation – Calcium Dipicolinat (Ca-DPA) 30.03.2017 Motivation – Calcium Dipicolinat (Ca-DPA) Ca-DPA ist Salz der Dipicolinsäure, welche ebenfalls in einigen Sporen zu finden ist. Ca-DPA = C7H3CaNO4 bildet monoklines Gitter mit 4 Molekülen / Zelle Spektroskopisch viel untersuchte Substanz, jedoch kaum mittels EDX. Detektion interessant für Brief- & Paketscanner etc. -2 Typen Ca-DPA -Bild: Dimer -Vorteile EDX (=Energiedispersive Röntgenspektroskopie) -ZIEL: NACHWEIS von Ca-DPA in Sporen PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 5

Einschub – Energiedispersive Röntgenbeugung (I) 30.03.2017 Einschub – Energiedispersive Röntgenbeugung (I) Röntgenstrahlung der Energie E hat Wellencharakter Interferenzphänomene Bragg-Gleichung Strukturanalysen winkel- und energiedispersiv möglich PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 6

Einschub – Energiedispersive Röntgenbeugung (II) 30.03.2017 Einschub – Energiedispersive Röntgenbeugung (II) Kristallstruktur festgelegt durch 14 Bravais-Gitter, sortiert nach Symmetrie (kubisch, tetragonal, rhombisch, …) Viele mögliche Streuebenen: Auch bei hohen Symmetrien viele Beugungsreflexe! ->Unterschiede der Spektren erläutern EDX:  (Messung von Use (Uran Selen) bei 0GPa und 45GPa, aufgenommen im HASYALAB, Hamburg)  ADX: (Messung von UTe bei 0GPa und 25GPa, aufgenommen im ESRF, Grenoble) PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 7

Messapparatur – Schematischer Aufbau 30.03.2017 Messapparatur – Schematischer Aufbau Fokus 3D - Objekt Primär- kollimator Streu- L Objektpunkt eff. Streuwinkel x z q s p fokussierter Röntgenstrahl PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 8

Messapparatur – Änderung des Messwinkels 30.03.2017 Messapparatur – Änderung des Messwinkels x y L z x z y L PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 9

Messapparatur – Änderung der Streublendenöffnung 30.03.2017 Messapparatur – Änderung der Streublendenöffnung x z y A x z y A PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 10

Röhren-Parameter & Datenaufnahme 30.03.2017 Röhren-Parameter & Datenaufnahme wesentliche Bestandteile der Röntgenanlage X-Ray-Tube (Philips) mit Wolfram-Röntgenanode: energieauflösender Ge-Halbleiter-Detektor (Eurisys Mesures) Röhren-Parameter Beschleunigungspannung bis 150keV Anodenstrom bis 10mA Datenaufnahme Vorbereitungen für die Datenauswertung Energie-Kanal-Eichung mittels charakteristischer Linien: in Kanal ; in Kanal Detektorspannung ( E) Vorverstärker MCA (2048 Kanäle) mit ADC „winTMCA“ (PC-Software) Mit Ge-Detektor + AD-Wandler + MCA Röhre – Energiebereich Energie – Kanal Kalibrierung -> 2punkt kalib -> formel Kanalnummer Energie [keV] PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 11

Normierung des Beugungsspektrums 30.03.2017 Normierung des Beugungsspektrums Problem: Lösung: Vorgehensweise: Aufnahme des Transmissionsspektrums: Detektion ungebeugter Photonen bei geringem Anodenstrom (I=1mA um Detektor nicht zu schädigen) Division des Beugungs- durch das Transmissionsspektrum (Für manche Energien ist die Intensität im Transmissionsspektrum nahe null Hohe Intensitäten im Divisionsspektrum, allerdings lediglich in uninteressanten Randbereichen.) Strahlungsintensität über Energien nicht konstant (aufgrund Bremsstrahlung & charakteristischer Linien) Normierung des Beugungsspektrums mittels Transmissionsspektrum: Abgesehen von Rauscheffekten lässt sich so obige Intensitätsabhängigkeit herausfiltern Mit Ge-Detektor + AD-Wandler + MCA Röhre – Energiebereich Energie – Kanal Kalibrierung -> 2punkt kalib -> formel PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 12

Messapparatur – Optimierung (I) 30.03.2017 Messapparatur – Optimierung (I) Vormessung mit Dipicolinsäure Bestimmung der Netzebenen- abstände d mittels Gauß-Fit d [A] rel. Intensität 3.189 100 6.278 9 5.259 22 4.547 12 3.652 25 2.730 18 2.422 27 Simulation PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 13

Messapparatur Optimierung (II) – mit xSim2001 v1.0 30.03.2017 Messapparatur Optimierung (II) – mit xSim2001 v1.0 xSim2001 v1.0 Im Rahmen einer Diplom-Arbeit für diese Röntgenanlage erstelltes Simulationsprogramm basierend auf „Monte Carlo Verfahren“ Anlagenparameter einstellbar (Blendenöffnungen, Winkel, ROI, zu untersuchendes Objekt sowie dessen Position) Simulation von Messungen (mit d-Werten) Durchführung von Simulationsläufen für verschiedene Blendensysteme und Beugungswinkel Ermittlung optimaler Parametereinstellungen entsprechende Konfiguration der Röntenbeugungsanlage Ergebnisse der besten Simulationen (Spektren) Beugungswinkel: 38mrad Primäre Beugungsblenden: 1te Konfiguration: oben:0.4 mm, unten 0.25 mm 2te Konfiguration oben:1.5 mm, unten:1.25 mm Sekundäre Beugungsblenden: gleiche Konfig. oben: 4.7/5.6 mm, unten 12.9/14 mm PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 14

Messapparatur Optimierung (II) – xSim2001 v1.0 Screenshot 30.03.2017 Messapparatur Optimierung (II) – xSim2001 v1.0 Screenshot Darstellung simulierter Beugungsmessungen PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 15

Messapparatur – Messung (I) 30.03.2017 Messapparatur – Messung (I) Im Folgenden führten wir folgende Messungen durch: 1. Messung: Ca-DPA mit kleinen Blenden + Transmission 2. Messung: Ca-DPA mit großen Blenden + Transmission 3. Messung: Sporen + Untergrund + Transmission PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 16

Messapparatur – Messung (II) 30.03.2017 Messapparatur – Messung (II) Ca-DPA Messung bei einem Winkel von 38mrad Primärblenden: 0.4mm / 0.25mm 1.5mm / 1.25mm PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 17

Messapparatur – Messung (III) 30.03.2017 Messapparatur – Messung (III) Sporen Messung bei einem Winkel von 38mrad Primärblenden: 1.5mm / 1.25mm Gemessene Spektren Divisionsspektrum PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 18

Auswertung – Normierung (I) 30.03.2017 Auswertung – Normierung (I) Division der Spektren, dann: Fit der Peaks und Bestimmung/Vergleich der d-Werte Untersuchung der Peakverbreiterung Rekonstruktion PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 19

Auswertung – Netzebenen (II) 30.03.2017 Auswertung – Netzebenen (II) Vergleich der d-Werte zu Referenz [1] Gute Übereinstimmung bei gleichen Anlagenparametern (kleine Blendenkonfiguration) Verschiebung zu größeren d-Werten bei größeren Blenden (wg. Asymmetrie) Peak Energie [keV] d [Å] Abweichung [%] 1 38.04 ± 0.02 8.584 ± 0.005 -2.8 2 50.36 ± 0.02 6.484 ± 0.003 -1.5 3 69.34 ± 0.08 4.710 ± 0.006 +2.8 4 82.52 ± 0.05 3.957 ± 0.002 +0.1 5 98.23 ± 0.09 3.324 ± 0.003 +2.3 PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 20

Auswertung – Blendenverbreiterung (III) 30.03.2017 Auswertung – Blendenverbreiterung (III) Aus der Winkelunsicherheit ΔΘ folgt eine Peakverbreiterung Bragg-Gleichung liefert Energie … und daher Unsicherheit Winkelunsicherheit nicht exakt bekannt Experimentelle Verbreiterungen aus Gauß-Fits werden gewichtet gefittet („Verbreiterungsfaktoren“) Abschätzung zeigt Überein- stimmung mit Größenordnung PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 21

Auswertung – Faltung (I) 30.03.2017 Auswertung – Faltung (I) Diskrete Faltung: Problem: Nicht-konstanter Faltungskern verursacht im diskreten Fall „stark nicht-stetige“ Resultate Blendenverbreiterung ΔE ~ E Korngrößenänderung ΔE ~ 1/E Abhilfe: Spline-Interpolation “zwischen zwei Kernen“ Realisierung eines Algorithmus mit Matlab PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 22

Auswertung – Faltung (II) 30.03.2017 Auswertung – Faltung (II) Verwendung von Gaußkernen Beispiel: Faltung von zwei Peaks mit lin. Verbreiterung ~ E PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 23

Auswertung – Faltung (III) 30.03.2017 Auswertung – Faltung (III) Rekonstruktion der gemessenen Ca-DPA-Spektren aus d-Werten Intensitäten Verbreiterungsfaktoren PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 24

Auswertung – Faltung (IV) 30.03.2017 Auswertung – Faltung (IV) Vergleich mit Simulation Fehlende d-Werte werden bestätigt Ähnlich Resultate, jedoch geringere Übereinstimmung PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 25

Auswertung – Faltung (V) 30.03.2017 Auswertung – Faltung (V) Ziel: Rekonstruktion des relevanten Bereich des Sporenspektrums aus Ca-DPA Spektrum Algorithmische Minimierung der Differenzspektren in Maximumnorm Annahmen Generelle Verschmierung durch biologische Probe (Grundverbreiterung) Korngrößenverkleinerung des kristallinen Ca-DPA (Scherrerverbreiterung) PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 26

Auswertung – Faltung (VI) 30.03.2017 Auswertung – Faltung (VI) Faltung von Ca-DPA Spektrum mit Verbreiterungskern Aufgabe: Suche Verbreiterung, s.d. Abstände der beiden Maxima im Sporenspektrum mit denen im gefalteten Spektrum etwa übereinstimmen: PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 27

Auswertung – Korngröße (I) 30.03.2017 Auswertung – Korngröße (I) Problem: Linker Peak weist zuwenig Intensität auf Möglicher Grund: Korngrößenverkleinerung Scherrer – Formel Hier ist Δ die Peakverbreiterung, K der Scherrer-Formfaktor und L die Korngröße Kleine Kristallite Größere Verbreiterung Idee: Faltung des verbreiterten Spektrums mit einem gemäß 1/E verbreiternden Kerns. PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 28

Auswertung – Korngröße (II) 30.03.2017 Auswertung – Korngröße (II) 1/E Kernverhalten kann ersten Peak vergrößern Recht gute Übereinstimmung, Abweichung 8-10 % Aber: Zu ungenau – Verbreiterung korrespondiert zu Korngrößen im Bereich ~1nm nach Scherrer PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 29

Fazit - Ist Ca-DPA in den Sporen nachweisbar...? 30.03.2017 Fazit - Ist Ca-DPA in den Sporen nachweisbar...? Zusammenfassung Vormessung & Simulation wichtige Voraussetzung zur Parameter-Optimierung Messung und Auswertung der aufgenommenen Spektren Bestimmung der d-Werte, Intensitäten Halbwertsbreiten Matlab-Analyse zur Rekonstruktion Sporen-Spektrums aus Ca-DPA-Spektrum mittels Faltung Fazit / Ausblick Spektrum konnte mittels Faltung rekonstruiert werden Ursachen der Verbreiterung nicht gänzlich geklärt Bilden eines Entfaltungskern: Sporen Ca-DPA Kurze Messzeiten & schnelle Algorithmen zur Auswertung für spätere kommerzielle Anwendung notwendig PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 30

30.03.2017 Quellen „Möglichkeiten zur Identifikation von Bakterien-Endosporen durch kohärente Röntgenstreuung“ Diplomarbeit 2004 DANIELA FELLINGER „The Crystal Structure of Calcium Dipieolinate Trihydrate (A Bacterial Spore Metabolite)“ Acta Cryst. (1968). B 24, 571 GERALD STRAHS AND RICHARD E. DICKERSON „Quantitative simulation of coherent X-ray scatter measurements on bulk objects“ Journal of X-Ray Science and Technology 12 (2004) 83-96 H. Bomsdorf, T. Müller, H. Strecker Wikipedia Commons PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 31

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit & Interesse 30.03.2017 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit & Interesse PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger Seite 32