Brettanomyces: Infektionsgefahr im Keller sowie Wachstumsvorteil im Keller Karin Mandl, Tina Paulus, Bejamin Frömbgen, Alexander Prange

Einleitung Wildhefe Brettanomyces In Weinkeller eingeschleppt Besiedelung von Holzfässern (Barrique) Fehlaromen, äußerlich keine Veränderung erkennbar Wachstumsbedingungen und Milieubevorzugung von Brettanomyces Brettanomyces ist eine Wildhefe, kommt häufig in Weingärten vor und kann dadurch leicht in Weinkeller eingeschleppt werden Besitzt Fähigkeit Holz abzubauen (Cellobiose), überdauert in Poren von Holz und Weinstein (d.h. ein großes Risiko besteht bei mehrfach verwendeten Holzfässern) Brettanomyces produziert hier Fehlaromen während im äußeren Erscheinungsbild keine Veränderungen erkennbar sind Wichtige Frage sind die Wachstumsbedingungen und die Milieubevorzugung von Brettanomyces (bzw. wie das Wachstum durch die Umwelteinflüsse beeinflusst wird) Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Vorkommen Baumharz, Boden, Wasser Molkereien Brauereien Weinkeller Holzfässer Trauben, Most und Wein Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Taxonomie Brettanomyces/Dekkera Gruppe: Deuteromyces Familie: Cryptococcaceae Gattung: Brettanomyces Asexuelle Form, kann keine Sporen bilden. Gruppe: Ascomycetes Familie: Saccharomycetaceae Unterfamilie: Saccharomycoideae Gattung: Dekkera Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Eigenschaften Wachstum langsam, ideal 25°C Vergärung langsam und schwächer als Saccharomyces cerevisiae, bis zu 12%vol. Alkohol Alkoholtoleranz sehr hoch, 14 -15% vol.Alkohol Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Verursachte Weinfehler Essigsäure- und Esterbildung Brett-Aroma – Pferdeschweiß verantwortlich: Ethylphenol, Ethylguajakol, Ethylcatechol Mäuseln Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Infektionsgefahr im Keller Zukauf von Fässern Klimaveränderung Infektion aus dem Freiland Infektion aus der Kellerluft Infektion mit Vektoren (Schlauch, Tupfer) Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Maßnahmen gezielte Reinigung von Fässern Vermeidung der Verwendung von zugekauften Fässern Maischestandzeiten in Holzgefäßen vermeiden Nieroster – oder Glasgebinde verwenden Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Maßnahmen Einsatz von autoclavierten Holzchips Für Holzfässer kurz öffnen und rasch wieder verschließen Holzfässer nur für die Lagerung verwenden Holzfässerreinigung auf seperaten Plätzen durchführen (Brettanomyces wird in die Luft freigesetzt) Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Einfluss des Toastinggrades auf das Wachstum von Brettanomyces und Identifikation mittels PNA -Technik Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Fragestellung Einfluss des Faktors Holz auf Brettanomyces Gibt es Vorkontaminationen bei Chips ? Wie wirken sich Eichenarten Toastinggrade auf die Vermehrung von Brettanomyces aus ? Hier betrachten wir, wie das eingesetzte Holz / Holzchips Brett. Beeinflusst (Die Fragestellung betrachtet den Einfluss des eingesetzten Holzes auf die Wachstumsbedingungen von Brettanomyces); d.h. die wichtigsten Fragen die wir stellen sind: Gibt es Vorkontaminationen bei Chips (wird Brettanomyces schon beim Chipseinkauf eingeschleppt) ? Und Wie wirken sich die verschiedenen Eichenarten, Toastinggrade, und Größen der Chips auf die Vermehrung von Brettanomyces im Wein aus ? Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Barrique - Eichenholzchips 200 Jahre alte Eiche 2 Fässer 2-3 Jahre Lagerung der Bretter Toasting bei 460-520°C Kosten: € 600-950 Eichenholz und Vorbehandlung wie bei Barrique-Fässern Toasting bei ca.200°C Kosten: € 12/kg Bei 225l (Fassvolumen eines Barrique) Wein benötigt man 2,025 kg Kosten: € 24,30 Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Versuch Überblick Gussplattenverfahren: Chips mit Agar übergossen, bei 28°C bebrütet Auszählung und Bestimmung der Keime durch PNA-FISH Methode Einfluss des Toastinggrades auf das Wachstum: Holzchips und Rotwein sterilisiert, Infektion mit Brettanomyces - Testkeim Dazu wurden – Im Gussplattenverfahren wurden Chips auf mögliche Vorkontaminationen untersucht (dazu wurden Chips mit Agar übergossen und bei 28°C bebrütet), Anschließend wurden die Keime ausgezählt und durch PNA – Fish Methode bestimmt. Zur Untersuchung, welchen Einfluss der Toastinggrad besitzt, Holzchips und Rotwein sterilisiert und mit Brettanomyces infiziert und mit einer Vergleichsprobe ohne Chipszugabe verglichen Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Vorkontamination der Chips? Hygienische Untersuchung der Eichenholzchips mittels Gussplattenverfahren Petrischalen mit Agar befüllt - 0,5g Chips/Platte - bei 28°C bebrütet Verdächtige Keime mikroskopisch und mit PNA-FISH-Technik analysiert Dr. Karin Mandl 28.8.2014

PNA - FISH Methode Fluoreszierende Sonden Bindung an spezifische DNA – Sequenzen einer Mikroorganismenart Durch Erregerlicht mikroskopisch sichtbar gemacht Abb.: Brettanomyces, Markierung mit fluoreszierenden Farbstoffen; Ein kurzer Blick auf die PNA – Fish – Methode: Hier werden Sonden eingesetzt, die einen fluoreszierenden Farbstoff tragen, diese binden an bestimmte DNA-Sequenzen einer Mikroorganismenart, Im Mikroskop beginnt der Farbstoff im Erregerlicht zu fluoreszieren (Fluoreszenz als Nachweis einer bestimmten Mikroorganismenart) Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Durchführung Überimpfen der verdächtigen Keime Membranfiltration Filter 40h bei 37°C bebrütet Fixierung, Hybridisierung und Waschung der Zellen Auswertung mit dem Fluoreszenz-Mikroskop Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Wachstum von B.bruxellensis in Abhängigkeit von Holz 5 Eichenholzchipsproben mit unterschiedlichem Toastinggrad sterilisierter Testwein mit 1g Holz versetzt bei 28°C 10 Tage bebrütet alle 2-3 Tage Zellzahl mittels Thomakammer bestimmt Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Ergebnisse Anzahl der verdächtigen Keime im Gussplattenverfahren Einfluss des Toastinggrades auf den hygienischen Zustand (Wachstumsraten des Brettanomyces - Testkeims, Vergleich mit Testkeim ohne Holzzugabe) Einerseits wurden die verdächtigen Keime von den Gussplatten ausgezählt (Keimbelastung der Chips feststellen) Andererseits die Wachstumsraten von Brettanomyces bei verschiedenen Chipsarten (Toastinggrad, Eichenart, Größe – Vgl. mit Testkeim ohne Holzzugabe) verglichen Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Gussplatten Identifizierung der Keime durch PNA – FISH Methode Keine Schädlings-hefen auf Gussplatten Durch Toasting-vorgang alle Hefen abgetötet 3 Eichenarten, 3 Toastinggrade untersucht; Anzahl der verdächtigen Keime erhoben und mittels PNA – Fish Methode identifiziert; Höchste Gesamtkeimzahl bei heavy getoasteten Chips (amerikanische Eiche) sowie frz. Und dt. Eiche (beide medium getoastet); Nach Anwendung der PNA – Fish Methode zeigt sich, dass keine Schädlingshefen, v.a. Brettanomyces auf den Gussplatten auftreten; Chips werden in Trommel gleichmäßig getoastet, wodurch die meisten Mikroorganismen abgetötet werden Fässer dagegen werden nur oberflächlich getoastet, Chips sind also im Gegensatz zu Fässern hygienischer (weisen geringere Keimzahlen auf); Abb.: Anzahl der verdächtigen Keime Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Wachstum B.bruxellensis in Abhängigkeit von Holz Probe 1: Dt. Chips – med Probe 2: Am.Chips – med Probe 3: Am.Chips – heavy Probe 4: Frz.Chips – med Probe 5: Testkeim ohne Holz Probe 6: Frz.Späne – light Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Toastinggrad + Keimzahl Probe Anfangsgehalt KZ / ml Endgehalt Wachstum Wachstumsrate bzgl. Vgl.probe dt.Eiche – med. 18.385 58.177 216,44 % 10,4x am.Eiche – med. 22.438 40.125 78,83 % 4,8x am.Eiche - heavy 20.000 85.568 327,84 % 15,8x frz.Eiche – med. 17.443 48.011 175,25 % 8,4x frz.Eiche -light 21.818 43.125 97,66 % 4,7x Vgl.probe 36.125 43625 20,76 %   Chipszugabe beschleunigt das Wachstum Toastinggrad wichtiger Einflussfaktor, höchster Keimzahlanstieg bei starkem Toastinggrad Untersuchung der Wachstumsraten von Brettanomyces bei verschiedenen Toastinggraden; Vgl. mit Testkeim ohne Holzzugabe; Die größten Wachstumsraten zeigen stärker getoastete Chips, die geringste Wachstumsrate bei der Vergleichsprobe; die Zugabe von Holzchips beschleunigt also das Wachstum von Brettanomyces; stärkstes Wachstum bei heavy getoasteten (328%), bei der Vgl.probe beträgt das Wachstum nur 21% (bei der höchsten Anfangskeimzahl); Holzzugabe erhöht die Wachstumsrate um das 10 bis 15fache, bei light getoasteten dagegen nur ums 4,7fache; Ursache dafür ist der Toastingvorgang, dieser führt zu Ligninabbau im Holz, diese Veränderung der Holzinhaltsstoffe begünstigt Brettanomyces; Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Zusammenfassung Brettanomyces erzeugt Fehlaromen Besitzt in Holzfässern Wachstumsvorteil gegenüber Saccharomyces cerevisiae Eichenholzchips selbst zeigen keine Hefekontamination Toastinggrad des Holzes hat starken Einfluss auf Brettanomyces - Wachstum Zum Abschluss die wichtigsten Punkte zusammenfassen: Wildhefe Brettanomyces erzeugt Fehlaromen ohne äußere Veränderung im Wein; Besitzt in Holzfässern einen Wachstumsvorteil gegenüber S.cerevisiae und überdauert in Poren; Eichenholzchips für Barriquebereitung zeigen selbst keine Hefekontamination (bringen keine Brettanomyces Hefen in Keller); Holzzugabe begünstigt das Wachstum von Brettanomyces, v.a. ein starker Toastinggrad kann die Wachstumsraten erhöhen; Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Einfluss von Holzchips auf die Nährstoffkomkurrenzbedingte Verdrängung von Brettanomyces durch Saccharomyces cerevisiae in der Weinbereitung Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Grundlage des Wachstumsvorteils stellt Cellobiose dar Dr. Karin Mandl 28.8.2014

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Versuchsaufbau VT I 12x Wiederholung in Glas Eprouvetten, Hybridisierung am Tag 1,2,3,4,8,10 Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Versuchsaufbau VT II 12x Wiederholung, Hybridisierung am Tag 1,2,4,8,10 Gärtemperatur 38°C im Brutschrank Überprüfung der Gebinde Serie M für Metall Serie P für Plastik Dr. Karin Mandl 28.8.2014

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Floureszenzmikroskop Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Verwendetet Hefestämme Oenoferm Klosterneuburg, Firma Erbslöh Dr. Karin Mandl 28.8.2014

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Versuch im Glas mit Holzchips Nullprobe ohne Brettanomyces und Holz Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Versuch im Glas ohne Holz Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Versuch im Glas mit Holz Ohne S. cerevisiae Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Metall Plastik Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Versuch im Metallgefäß mit Holz Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Versuch in Plastik mit Holz Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Zusammenfassung Das Wachstum von Brettanomyces wird am Anfang von S.c gefördert Das Wachstum mit Holz und mit Plastik ist vergleichbar Das Wachstum ohne S.c führt zu einer hohen Anzahl von Brettanomyces Dr. Karin Mandl 28.8.2014

Herzlichen Dank für die Aufmerksamkeit Dr. Karin Mandl 28.8.2014