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PCR basierte- Detektionstechniken Mi21 Martina Jahn 08.02.20162.

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Präsentation zum Thema: "PCR basierte- Detektionstechniken Mi21 Martina Jahn 08.02.20162."—  Präsentation transkript:

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2 PCR basierte- Detektionstechniken Mi21 Martina Jahn

3 Anwendung 1. Forensische Analysen DNA- Abstammungsanalysen (Vaterschaftstests, Kriminalistik) 2. Mikrobielle Gemeinschaften: Biofilme, medizinische Mikrobiologie 3. Gentechnisch hergestellte Lebensmittel Mi21 Martina Jahn

4 Anwendung Mi21 Martina Jahn minimale Mengen an DNA ausreichend zeitsparend schneller Überblick kulturunabhängig

5 Mi21 Martina Jahn Strangtrennung durch kurzzeitiges Erhitzen der DNA auf 95°C Hybridisierung der Primer bei spezifischer Annealingtemperatur DNA-Synthese bei 72°C durch eine hitzeresistente DNA- Polymerase Kary B. Mullis Nobelpreis 1993 PCR- Methode (

6 Mi21 Martina Jahn Sequenzierung von PCR-Fragmenten nach Sanger 6 Frederic Sanger Nobelpreis für Chemie 1980

7 1. Humane Anwendungen Mi21 Martina Jahn DNA-Abstammungsanalysen Forensische Analysen Ahnenforschung (Analyse fossiler DNA)

8 „Fingerprinting“ bei Menschen Mi21 Martina Jahn WS 10/11 8 Tandem-Repeat-Polymorphismen durch repetitive Cluster charakterisiert in nicht-kodierenden Bereichen der DNA (Introns, Pseudogene). co-dominante Vererbung Short Tandem Repeats (STR) Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) Fragmentlängen-Analyse

9 Forensic Mi21 Martina Jahn Chromosomen (Mensch) Genorte (Stand 2011): D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, Amelogenin, vWA, D8S1179, TPOX und FGA DNA-Abschnitte: Mikrosatelliten : meist VNTRs seit 1998: STRs Wahrscheinlichkeit. 2 Individuen = gleiche Anzahl von wiederholten Repeats: 1 zu mehreren Milliarden!!!

10 DNA Abstammungsanalysen Mi21 Martina Jahn Mikrosatelliten sind kurze Abschnitte der DNA, die in verschieden häufigen Wiederholungen vorliegen (Fragmentlängen-Analyse). Die Anzahl der Wiederholungen unterscheiden sich von Mensch zu Mensch, die Kombination des Musters dieser Wiederholungen sind einzigartig. Sie werden aber - zusammen mit dem gesamten Erbgut - von den Eltern an Ihre Kinder vererbt. Die Vererbung und die Vielfältigkeit (Polymorphie) der Mikrosatelliten machen Sie zu idealen Markern für eine genetische Abstammungsanalyse.

11 Vaterschaftstest Mi21 Martina Jahn  M Kindsmutter  K Kind  PV Putativvater AB

12 Eineiigige Zwillinge Mi21 Martina Jahn ?????????????? Fingerabdruck Anatomisch Genetisch Krankheiten

13 Eineiige Zwillinge Mi21 Martina Jahn WS 14/15 13 Unterscheiden sich eineiige Zwillinge? Anatomisch?Leberflecke (u.a.), Muttermale genetisch?Nein; epigenetisch verändertes Methylierungsmuster an DNA & Histon-Acetylierungen V(D)J-Regionen der T- & B-Lymphozyten des Immunsystems (adaptive Immunsystem) Krankheiten/Allergien? Nicht zwingend Nussallergie65% (7% bei 2-eiigen) Asthma20% Fingerabdruck: Papillarleisten ?Nein; (umweltfaktorische Ausnahmen)

14 2. Mikrobiologische Anwendungen Mi21 Martina Jahn Identifizierung von Mikroorganismen in unterschiedlichen Habitaten Erregernachweis bei Infektionskrankheiten Phylogenetische Analysen

15 Phylogentische Marker Mi21 Martina Jahn Ribosomale RNA (5S, 16S, 23S) Spezifische Gene (z.B. rpoN) Phospholipide, Fettsäuren Internal Transcribed Spacer Regions (ITS )

16 16S rRNA Mi21 Martina Jahn DNA Protein Strukturelle und katalytische Komponente der Ribosomen Hohe Kopienzahl Ca Basenpaare Ribosom

17 16S rRNA Mi21 Martina Jahn S und 5S rRNA 16S rRNA Bakterielles 70S Ribosom E. Coli Thomas Steitz Nobelpreis 2009 X-stal structure ribosom

18 16S rRNA Mi21 Martina Jahn Mutationen oft letal Konstanter Selektionsdruck Sekundärstruktur an vielen Stellen hochkonserviert Vergleich analoger variabler Bereiche Datenbanken

19 Fingerprinting „Bakteriengemeinschaften“ Mi21 Martina Jahn

20 Analytik Mi21 Martina Jahn Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP)* Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)* Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TGGE)* Amplified rDNA Restriction Analysis (ARDRA)* Terminal Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (tRFLP) * = gelbasierende Auftrennung der PCR-Amplifikate

21 z. Bsp.: SSCP Mi21 Martina Jahn Unterscheidung von DNA-Molekülen derselben Länge aber unterschiedlicher Sequenz Auftrennung nach Sekundärstruktur der einzelsträngigen PCR Produkte DNA - Konformation ändert Laufverhalten Trennung in nicht-denaturierendem Polyacrylamidgel 5`- Primer trägt Phosphatrest

22 Prinzip SCCP-Gel Mi21 Martina Jahn GCGC G G + - ATAT T T + - Bakterium A Bakterium B

23 Analytik SSCP Gel Mi21 Martina Jahn Densiometrische Ableitung

24 Datenanalyse - Profilvergleich Mi21 Martina Jahn

25 3. Gentechnisch hergestellte Lebensmittel Mi21 Martina Jahn

26 Mi21 Martina Jahn Vorraussetzungen zur Generierung einer gentechnisch veränderten Pflanze 1.Kultivierung einer individuellen Pflanzenzelle (Protoplast oder Zellkultur) 2.Regenerierung zur vollständigen Pflanzenzelle aus Protoplasten oder Zellkultur 3.Änderung des Nucleus der Pflanzenzelle durch Insertion neuen genetischen Materials (DNAs) -Plasmid mit Fremdgen über/in Agrobacterium -mechanisch, durch „gene gun“ Methode Infizierte Maispflanze

27 Mi21 Martina Jahn Insertion neuen Genetischen Materials Über Agrobacterium

28 Gene Gun Mi21 Martina Jahn Alternative Methode der Gen Insertion – “Gene Gun”

29 Mi21 Martina Jahn Screen nach transformierten Pflanzen– Antibiotika Resistenz: Problem: Wie kann man von 1 bis 1000 Pflanzen die gentechnisch veränderte erkennen? Lösung: man koppelt die Antibiotika –Resistenz mit dem Gen, welches genetisch entfernt wird 1.Kultivierung einer individuellen Pflanzenzelle (Protoplast oder Zellkultur) 2.Regenerierung zur vollständigen Pflanzenzelle aus Protoplasten oder Zellkultur 3.Änderung des Nucleus der Pflanzenzelle durch Insertion neuen genetischen Materials (DNAs) -Plasmid mit Fremdgen über/in Agrobacterium -mechanisch, durch „gene gun“ Methode

30 Gentechnisch veränderter Mais Mi21 Martina Jahn Bt – Bacillus thuringiensis – ubiquitär vorkommendes Bakterium Produziert Proteine (“crystal proteins”, Cry [>60]) welche selektiv bestimmte Gruppen von Insekten tötet - Magen toxins, müssen von Insekten gefressen werden um tödlich zu wirken - Proteine binden an Darmrezeptoren  Insekt stoppt Nahrungsaufnahme/verhungert - seit 30 Jahren werden Bt Toxine als Pestizide in Mio to/Jahr auf Feldern versprüht

31 „Corn Borer Impact“ Mi21 Martina Jahn U.S. + Canada: > $1 Mrd per annum, Schaden und Kontrollkosten D > Euro Maiszünsler (Ostrinia nubilalis), westliche Maiswurzelbohrer (Diabrotica virgifera)

32 Gefahren durch Genmais? Mi21 Martina Jahn Potentielles Risiko für Menschen auf allergische Reaktionen? - Toxizität der Cry Proteine für Menschen ≤ Null - Cry1 – wird über Magensäure unschädlich für Menschen degradiert - Cry9 – moment. im Tier (Maus) Modell untersucht (bisher keine Tox.) 2.Tötlich für andere Insektenarten? (select. für Lepidopterane): - Monarch Schmetterlinslarve ja: Bt Toxin, aber Schmetterling geht nicht auf Maispflanze

33 Mi21 Martina Jahn Transgener Reis Anbau + H 2 O Ist – H 2 O Gewünscht – H 2 O Raipur Indien 2005

34 Mi21 Martina Jahn Transgener Golden Reis Gentechnisch verändert: Enthält ß Carotin, welches sich in Vitamin A umwandelt

35 Mi21 Martina Jahn Gentomate „ Anti-Matschtomate“ 1994 Flavr Savr Tomate: entwickelt in USA; von Monsanto auf dem Markt 1997 mangels Nachfrage eingestellt 2010: indische Forscher: Tomaten haltbarer durch α-Mannosidase und ß-D-N-Acethylhexosaminidase die das Weichwerden Der Tomaten inhibieren (für zusätzliche 30 Tage)

36 Mi21 Martina Jahn Transgene Baumwolle Ein oder mehrere Gene des Bodenbakteriums B. thuringiensis werden in die chromosomale DNA der Baumwollpflanze integriert → produzieren Toxine gegen Schädlinge (Käfer, Schmetterlinge, Zweiflügler, Baumwolleule Transgene Baumwolle wurde 2009 in 12 Ländern angebaut: Argentinien (95%), Australien (95%), Brasilien (18%), Burkina Faso (29%), China (60%), Indien (89%), Kolumbien (31%, 2007), Mexiko (56,5%), Südafrika (98%), USA (88%), Indonesien, und Costa Rica. Baumwollkapselbohrer

37 Mi21 Martina Jahn Warum die öffentliche Angst über Biotech Lebensmittel? Unwissenheit über die Technologie Fehlen verlässlicher Informationen Unwissenheit über genetisch eingebaute „Safeguards“ Negative Medienpräsens und –meinung Opposition durch Aktivistengruppen Misstrauen der Industrie

38 Mi21 Martina Jahn


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