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Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum 1 Georg Weitzer, Ernst Müllner Max F. Perutz Laboratories (MFPL) Department für Medizinische Biochemie.

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1 Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum 1 Georg Weitzer, Ernst Müllner Max F. Perutz Laboratories (MFPL) Department für Medizinische Biochemie Medizinische Universität Wien, Jan 2007 Diese Präsentation befindet sich auf der Lehr-Inhalts Seite des Departments für Medizinische Biochemie unter der Adresse:

2 Literatur Ergänzung der theoretischen Grundlagen und biochemisches Praktikum im Block 3 - vom Molekül zur Zelle Facultas Verlag Hans Goldenberg (Hg.) Zellbiologie, Wiley - Verlag Chemie Bruce Alberts ergänzend z.B. Chemie erleben (Abschnitt Analytische Chemie), Facultas - Universitäts Taschenbuch Verlag Edgar Wawra, Helmut Dolznig, Ernst Müllner Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

3 Der praktische Teil der 1. Übung findet statt am: Institut für Medizinische Chemie Währingerstraße 10 Übungssaal III (Tiefparterre)

4 DünnschichtchromatographieDünnschichtchromatographie IonenaustauschchromatographieIonenaustauschchromatographie Reversed Phase Chomatography (apolare stationäre Phase, polares Elutionsmittel = mobile Phase)Reversed Phase Chomatography (apolare stationäre Phase, polares Elutionsmittel = mobile Phase) GaschromatographieGaschromatographie Gelfiltration (Größenausschluss Chromatographie)Gelfiltration (Größenausschluss Chromatographie) ElektrophoreseElektrophorese AffinitätschromatographieAffinitätschromatographie Trennmethoden Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

5 : Affinitätschromatographie: z.B. Reinigung eines Enzyms aus einer komplexen Mischung von Proteinen

6 Praktikumsbeispiel 1 Trennung von Aminosäuren mittels Dünnschichtchromatographie (nach ihrer Polarität) Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

7 Glasröhrchen Zellulose auf Alufolie, polare, stationäre Phase Standard = Referenzwert Auftragen der Proben Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

8 Auftragen der Proben Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

9 Laufmittel, apolar, mobile Phase 35% Azeton / 35% n-Butanol in Acetatpuffer Dünschicht- Chromatographie- folie in Glastrog mit Laufmittel stellen Wanderungs- richtung der Proben Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

10 Dünnschichtchromatographie Trog gelber Farbstoff = Isatin Chemie erleben Wawra et al.

11 nach circa 2 Stunden: Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

12 Front Start Markieren der Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

13 Dünschichtchromatogramm nach der Färbung / Trocknung Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

14 Front Start Wanderungs- strecke der mobilen Phase Wanderungsstrecke der Aminosäure W(as) W(m) Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

15 Nernstscher Verteilungssatz Verteilungskoeffizient c = W(as) = Rf(as) W(m) Rf = Retentionsfaktor [Aminosäure] stationäre Phase [Aminosäure] mobile Phase Chemie erleben, Wawra et al. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Auswertung

16 Nernstscher Verteilungssatz Beschreibt die Verteilung eines Stoffes zwischen zwei miteinander nicht mischbaren Phasen (z.B. gasförmig / flüssig oder flüssig / fest oder flüssig / flüssig). Verteilungskoeffizient c = [Br 2 ] Chloroform [Br 2 ] Wasser Chemie erleben Wawra et al. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

17 Praktikumsbeispiel 2 Gelfiltration Trennung der Moleküle nach ihrer Größe Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

18 Gelfiltration Probe, z.B. Protein / Salz Gemisch Poren und Kapillaren kleine Moleküle können hinein, haben dadurch einen längeren Weg zurückzulegen als die großen, (die außen herum schwimmen) und kommen daher später aus der Säule heraus. Glasfritte kleine Moleküle große Fraktionen Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

19 Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemisches mittels Gelfiltration Sephadex G25 Säulenmaterial in Elutionspuffer äquilibriert. 0.5 ml der Probe (Dextranblau und Methylrot) direkt auf die gerade trockengelaufene Glasfritte auftragen. Wenn vollkommen ins Säulenmaterial eingedrungen, mit ca. 5 ml Elutionspuffer nachspülen, 3 mal wiederholen. Austretender Elutionspuffer wird in Fraktionen zu je 20 Tropfen (= ca. 1 ml) gesammelt. Um Methylrot sichtbar zu machen, Fraktionen mit je 1 Tropfen HCl ansäuern. Dextranblau ist blau gefärbt. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

20 Gelfiltrations - Chromatographie Säule Chemie erleben, Wawra et al. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

21 Elutionspuffer in Dispenserflasche Dextransblau / Methylrot Farbstoffmischung Salzsäure (HCl) zum Ansäuern und Entwickeln der Rotfärbung von Methylrot Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Reagenzien für die Gelfiltration

22 Gelfiltration Gelfiltration Sammeln der Fraktionen Chemie erleben, Wawra et al.

23 Fraktionen nach der Gelfiltration Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

24 Schema der Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemisches mittels Gelfiltration Fraktionen Farbintensität Dextranblau: großes Molekül, eluiert zuerst Methylrot: kleines Molekül, kommt später aus der Säule heraus Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

25 Praktikumsbeispiel 3 Elektrophorese Trennung von geladenen Molekülen im elektrischen Feld Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

26 Trennung und quantitative Analyse der Serumproteine Voraussetzungen: Serumproteine müssen positiv oder negativ geladen sein. richtige Wahl des Puffers ! Trägermaterial (analog zur stationären Phase) Gleichstromquelle Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

27 Arbeitsplatz Elektrophorese Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

28 Elektrophorese Apparatur Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

29 pipettieren kleiner Volumina pipettieren kleiner Volumina mit automatische Pipetten Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

30 Elektrophorese - Probenvorbereitung Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

31 Proben aufgetragen Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

32 Cellogel, Trägermaterial Tröge mit Pufferlösung Platin Elektroden Gleichstromquelle + Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Anode Kathode

33 Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen? Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

34 Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen? Der isoelektrische Punkt pI der Serumproteine ist ~ 5. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

35 Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen? Der isoelektrische Punkt pI der Serumproteine ist ~ 5. Daher muss der pH des Puffer > 5 sein (in der Praxis bei etwa pH = 9), damit ALLE Proteine negativ geladen werden... Chemie erleben, Wawra et al. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/ ansonsten würden der Anteil an positiv geladenen Proteinen zur Kathode wandern

36 Gleichstromquelle + Proben Standard Serum 250V 30 min Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Anode Kathode negativ geladene Proteine (Anionen) wandern zur positiv geladenen Anode Wanderungsrichtung

37 Zwischenfrage: Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie Na +, K +, Ca ++, Mg ++ als Anionen, wie Cl -, HCO 3 - ? Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

38 Zwischenfrage: Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie Na +, K +, Ca ++, Mg ++ als Anionen, wie Cl -, HCO 3 - ? Weil die Anionenlücke durch die negative Ladung der Proteine bei pH 7.4 ausgeglichen wird. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

39 Gleichstromquelle: 250 V Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

40 Nach der Elektrophorese Färben der Proteine Trägermaterial durchsichtig machen Photometrische (densitometrische) Auswertung Messen der Farbstoffdichte entlang des Trägermaterials Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

41 aufgetrennte Serumproteine Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

42 Fläche ist proportional der Farbmenge, also auch der Proteinmenge Detektor Lichtquelle Probe wird am Detektor vorbeigezogen Das Prinzip der Auswertung... Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

43 E = x c x d Küvette d = 1 cm PrismaLichtquelle E = log (1/T) = log (I 0 /I) Detektor II0I0... beruht auf dem Lambert-Beerschen Gesetz E = Extinktion = spez. Molarer Extinktionskeoff. c = Konzentration d = Schichtdicke Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 Photozelle

44 verwendetes Densitometer (ein Typ von Photometer) Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

45 Ausdruck der Ergebnisse Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

46 Elektrophorese von Serumproteinen Chemie erleben Wawra et al. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

47 diagnostische Aussage- möglichkeiten diagnostische Aussage- möglichkeiten (Beispiele) für eine ausführlichere Darstellung siehe z.B. laborbefunde/ lbef_ephorese_ eiweiss.htm Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 aus: Ergänzung der theoretischen Grundlagen, H. Goldenberg, (Hg.)

48 Protokoll zur Bewertung der Ergebnisse Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

49 Fotos: Gelfiltration-Auswertung neu fertige Aminosäure-Dünnschicht neue Ausdrucke Densitometer Foto Lageplan Foto Med. Chem. Gebäude (von Homepage) Informationen zur Protein-Elpho: Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007


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