Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum 1

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1 Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum 1
Diese Präsentation befindet sich auf der Lehr-Inhalts Seite des Departments für Medizinische Biochemie unter der Adresse: Georg Weitzer, Ernst Müllner Max F. Perutz Laboratories (MFPL) Department für Medizinische Biochemie Medizinische Universität Wien, Jan 2007

2 Literatur Ergänzung der theoretischen Grundlagen und biochemisches Praktikum im Block 3 - vom Molekül zur Zelle Facultas Verlag Hans Goldenberg (Hg.) Zellbiologie, Wiley - Verlag Chemie Bruce Alberts ergänzend z.B. Chemie erleben (Abschnitt „Analytische Chemie“), Facultas - Universitäts Taschenbuch Verlag Edgar Wawra, Helmut Dolznig, Ernst Müllner Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

3 Der praktische Teil der 1. Übung findet statt am:
Institut für Medizinische Chemie Währingerstraße 10 Übungssaal III (Tiefparterre)

4 Trennmethoden Dünnschichtchromatographie
Ionenaustauschchromatographie Reversed Phase Chomatography (apolare stationäre Phase, polares Elutionsmittel = mobile Phase) Gaschromatographie Gelfiltration (Größenausschluss Chromatographie) Elektrophorese Affinitätschromatographie Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

5 Affinitätschromatographie:
z.B. Reinigung eines Enzyms aus einer komplexen Mischung von Proteinen

6 Praktikumsbeispiel 1 Trennung von Aminosäuren mittels Dünnschichtchromatographie (nach ihrer Polarität) Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

7 Auftragen der Proben Zellulose auf Alufolie, polare, stationäre Phase
Glasröhrchen Standard = Referenzwert Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

8 Auftragen der Proben Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

9 Dünschicht- Chromatographie- folie in Glastrog mit Laufmittel stellen
Wanderungs- richtung der Proben Laufmittel, apolar, mobile Phase 35% Azeton / 35% n-Butanol in Acetatpuffer Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

10 Dünnschichtchromatographie Trog
Chemie erleben Wawra et al. gelber Farbstoff = Isatin

11 nach circa 2 Stunden: Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

12 Markieren der Front Start Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

13 Dünschichtchromatogramm nach der Färbung / Trocknung
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

14 Wanderungs- strecke der mobilen Phase Wanderungsstrecke der Aminosäure
Front Wanderungs- strecke der mobilen Phase Wanderungsstrecke der Aminosäure W(as) W(m) Start Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

15 Auswertung W(as) = Rf(as) W(m) Rf = Retentionsfaktor
Chemie erleben, Wawra et al. Nernstscher Verteilungssatz Verteilungskoeffizient c = [Aminosäure] mobile Phase [Aminosäure] stationäre Phase Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

16 Verteilungskoeffizient c =
Nernstscher Verteilungssatz Beschreibt die Verteilung eines Stoffes zwischen zwei miteinander nicht mischbaren Phasen (z.B. gasförmig / flüssig oder flüssig / fest oder flüssig / flüssig). [Br2] Wasser Verteilungskoeffizient c = [Br2] Chloroform Chemie erleben Wawra et al. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

17 Praktikumsbeispiel 2 Gelfiltration
Trennung der Moleküle nach ihrer Größe Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

18 Gelfiltration Probe, z.B. Protein / Salz Gemisch Poren und Kapillaren
kleine Moleküle können hinein, haben dadurch einen längeren Weg zurückzulegen als die großen, (die außen herum schwimmen) und kommen daher später aus der Säule heraus. Glasfritte große kleine Moleküle Fraktionen Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

19 Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemisches mittels Gelfiltration
Sephadex G25 Säulenmaterial in Elutionspuffer äquilibriert. 0.5 ml der Probe (Dextranblau und Methylrot) direkt auf die gerade trockengelaufene Glasfritte auftragen. Wenn vollkommen ins Säulenmaterial eingedrungen, mit ca. 5 ml Elutionspuffer nachspülen, 3 mal wiederholen. Austretender Elutionspuffer wird in Fraktionen zu je 20 Tropfen (= ca. 1 ml) gesammelt. Um Methylrot sichtbar zu machen, Fraktionen mit je 1 Tropfen HCl ansäuern. Dextranblau ist blau gefärbt. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

20 Gelfiltrations - Chromatographie Säule
Chemie erleben, Wawra et al. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

21 Reagenzien für die Gelfiltration
Elutionspuffer in Dispenserflasche Dextransblau / Methylrot Farbstoffmischung Salzsäure (HCl) zum Ansäuern und Entwickeln der Rotfärbung von Methylrot Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

22 Gelfiltration Sammeln der Fraktionen
Chemie erleben, Wawra et al.

23 Fraktionen nach der Gelfiltration
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

24 Schema der Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemisches mittels Gelfiltration
Farbintensität Fraktionen Dextranblau: großes Molekül, eluiert zuerst Methylrot: kleines Molekül, kommt später aus der Säule heraus Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

25 Praktikumsbeispiel 3 Elektrophorese
Trennung von geladenen Molekülen im elektrischen Feld Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

26 Trennung und quantitative Analyse der Serumproteine
Voraussetzungen: Serumproteine müssen positiv oder negativ geladen sein. richtige Wahl des Puffers ! Trägermaterial (analog zur stationären Phase) Gleichstromquelle Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

27 Arbeitsplatz Elektrophorese
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28 Elektrophorese Apparatur
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29 pipettieren kleiner Volumina mit automatische Pipetten
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30 Elektrophorese - Probenvorbereitung
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31 Proben aufgetragen Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

32 + Tröge mit Pufferlösung Cellogel, Trägermaterial Anode Kathode Platin
Elektroden Gleichstromquelle Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

33 Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen?
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

34 Der isoelektrische Punkt pI der Serumproteine ist ~ 5.
Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen? Der isoelektrische Punkt pI der Serumproteine ist ~ 5. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

35 Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen?
Der isoelektrische Punkt pI der Serumproteine ist ~ 5. Daher muss der pH des Puffer > 5 sein (in der Praxis bei etwa pH = 9), damit ALLE Proteine negativ geladen werden ... Chemie erleben, Wawra et al. ... ansonsten würden der Anteil an positiv geladenen Proteinen zur Kathode wandern Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

36 + Anode Proben Kathode 250V 30 min Standard Serum Gleichstromquelle
negativ geladene Proteine (Anionen) wandern zur positiv geladenen Anode Wanderungsrichtung Anode Proben Kathode 250V 30 min Standard Serum Gleichstromquelle Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

37 Zwischenfrage: Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie Na+, K+, Ca++, Mg++ als Anionen, wie Cl-, HCO3- ? Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

38 Zwischenfrage: Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie Na+, K+, Ca++, Mg++ als Anionen, wie Cl-, HCO3- ? Weil die Anionenlücke durch die negative Ladung der Proteine bei pH 7.4 ausgeglichen wird. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

39 Gleichstromquelle: 250 V Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

40 Nach der Elektrophorese
Färben der Proteine Trägermaterial durchsichtig machen Photometrische (densitometrische) Auswertung Messen der Farbstoffdichte entlang des Trägermaterials Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

41 aufgetrennte Serumproteine
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42 Probe wird am Detektor vorbeigezogen
Das Prinzip der Auswertung ... Fläche ist proportional der Farbmenge, also auch der Proteinmenge Detektor Lichtquelle Probe wird am Detektor vorbeigezogen Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

43 E = e x c x d ... beruht auf dem Lambert-Beerschen Gesetz
E = log (1/T) = log (I0/I) E = Extinktion e = spez. Molarer Extinktionskeoff. c = Konzentration d = Schichtdicke I0 I Photozelle Lichtquelle Prisma Küvette d = 1 cm Detektor Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

44 verwendetes Densitometer (ein Typ von Photometer)
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45 Ausdruck der Ergebnisse
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46 Elektrophorese von Serumproteinen
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47 diagnostische Aussage- möglichkeiten (Beispiele) für eine ausführlichere Darstellung siehe z.B. laborbefunde/ lbef_ephorese_ eiweiss.htm aus: “Ergänzung der theoretischen Grundlagen”, H. Goldenberg, (Hg.) Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007

48 Protokoll zur Bewertung der Ergebnisse
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49 Fotos: Gelfiltration-Auswertung neu fertige Aminosäure-Dünnschicht
neue Ausdrucke Densitometer Foto Lageplan Foto Med. Chem. Gebäude (von Homepage) Informationen zur Protein-Elpho: Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL /2007