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Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand? Dr. med. Guido Heymann Zentrale Abteilung für Laboratoriumsmedizin DRK-Kliniken Berlin.

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Präsentation zum Thema: "Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand? Dr. med. Guido Heymann Zentrale Abteilung für Laboratoriumsmedizin DRK-Kliniken Berlin."—  Präsentation transkript:

1 Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand? Dr. med. Guido Heymann Zentrale Abteilung für Laboratoriumsmedizin DRK-Kliniken Berlin

2 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?2 Themen.. Molekulargenetische Methodik Verfügbare Systeme Indikationen Beispiele AB0 Rhesus MNS Kosten und Aufwand Fazit

3 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?3 Grundlagen Ziel der PCR- Untersuchung chromosome Zellkern Doppelsträngiges DNA Molekül Individual nucleotides RNA Zellkern RNA Protein Ziel der Serologie

4 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?4 Molekulargenetische Methodik DNA-Vervielfältigung durch Polymerase-Kettenreaktion Verlängerung (Extension) DNA-Vorlage (Template) Anlagerung Primer (anneal) Forward primer Reverse primer Stränge werden getrennt Denaturierung

5 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?5 Molekulargenetische Methodik DNA-Vervielfältigung erfolgt Exponentiell 1,07*10 9 Kopien der Zielregion werden bei 100% Effizienz in ca. 32 Zyklen erzeugt. Original-DNA Zielregion Thermal cycle

6 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?6 Molekulargenetische Methodik Amplifikatdarstellung

7 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?7 Molekulargenetische Methodik Sequenzierung Amplifikat wird in die Kapillare injiziert Spannung wird angelegt Amplifikattrennung durch Länge: Große Stränge wandern langsamer durch das Gel Amplifikate wandern zur Anode Farbfluoreszenz der endständigen Base wird detektiert Detektor Fenster

8 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?8 Molekulargenetische Methodik weitere eingesetzte Verfahren Restriktionsfragment- Längenpolymorphismen (RFLP) PCR-SSO (sequenzspezifische Oligonukleotide) Real-time-Verfahren Schmelzkurvenanalyse

9 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?9 Vorschriften Richtlinien: Abschnitt Die Wahl des Untersuchungsverfahrens ist unter Berücksichtigung des aktuellen Wissensstandes zu treffen. MPG, Qualitätssicherung Ringversuch (INSTAND): AB0, Rhesus, Kell, Duffy, Kidd, MNS Kontrollen, Testreagenzien

10 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?10 Verfügbare Testsysteme Kommerziell erhältlich: AB0 Rhesus Kell, (Kk, Kp(ab)) Kidd MNS Duffy Lutheran Cartwright (Yt) Colton (Co) Knops Wright, Diego (Di) Dombrock (Do) sonstwie durchgeführt: McCoy Chido,Rodgers Js(ab) Lewis Xg Landsteiner-Wiener Gerbich Cromer Ii XK, Js(ab) Scianna T/Tn P-Globoside H/h Indian GIL, JMH, OK, RAPH b i s h e r n i c h t t e s t b a r ( z. B. ) : V e l L a n

11 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?11 Verfügbare Testsysteme: eigene Tests Interessante Web-Seiten zum Thema: The Blood Group Antigen Gene Mutation Database: projects/mhc/xslcgi.fcgi? cmd=bgmut/home Rhesusbase: ~fwagner/RH/RB/ NCBI Entrez Nucleotide entrez/

12 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?12 Indikationen wissenschaftliche Fragestellungen Zur Ergänzung von nicht eindeutigen serologischen Ergebnissen Wenn keine serologischen Untersuchungen möglich sind: unsichere Antigenbestimmung bei Vortransfusion, Polyagglutinationsphänomen oder z.B. AIHA Bestimmung erythrozytärer Merkmale aus fetalen Materialien genetische Disposition bei Risikoschwangerschaften Untersuchung nach KMT, bei Chimärismus forensische Fragestellungen Vaterschaftsbegutachtung kriminalistische Zuordnung von Spuren zu Tätern

13 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?13 Beispiele: AB0 Das Gen für die AB0-Transferasen liegt an Position 9q34.1-9q34.2 Es kodiert für ein Enzym, das endständige Zucker an eine Grundsubstanz (H) anhängt Aminosäurevarianten verursachen: geringere Transferaseaktivität Spezifitätswechsel des endständigen Zuckers

14 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?14 Beispiele: AB0 AS-Pos A101ProArgPheGlyLeuGlyAspArg A201Leu# B101GlySerMetAla B301GlySerMetAlaTrp 0o1 Basenmutation in Codon 87 erzeugt vorzeitiges Stopcodon 0o3GlyArg cisABLeuAla Aktuell sind 168 Allele beschrieben (A 57, B 40, besondere 5) # Deletion eines Nukleotids erzeugt Frameshiftmutation mit zusätzlich 21 AS

15 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?15 Beispiele: AB0 Probleme der AB0-Typisierung: Es existiert keine klare Vergleichbarkeit zwischen dem Allel und der serologischen Reaktion. Die Wertigkeit (Auswirkungsstärke) der spezifischen Aminosäuren an speziellen Positionen ist nicht klar (z.B. B-Transferase weil Ala268 oder Gly176, nondeletionales 0-Allel). Letzter Ausschluß von A101 nur durch Fehlen von Missense- oder Nonsensemutation in den Exonen 1 bis 7 (Sequenzierung). Transfusionsrelevanz ?!

16 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?16 Beispiele: Rhesus günstige Situation: nicht glycosyliertes Membranprotein Testmöglichkeiten: RhD, C,c,E,e,Cw.. schwaches D: Dweak oder D partial D-Zygotiebestimmung CE-Haplotypbestimmung

17 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?17 Beispiele: Rhesus

18 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?18 Beispiele: Rhesus

19 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?19 Beispiele: Rhesus

20 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?20 Beispiele: Rhesus Probleme der Rhesus-Typisierung: PCR-positiv Serologie-negativ durch seltene Basenmutationen, die D (oder auch CE) unterdrücken. Was wird kodiert – was wird exprimiert? c (Cyt 48) -> Intron 4 Testung für C bisher >170 Allele allein im D-Gen und 53 verschiedene Dweak beschrieben -> Sequenzierung

21 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?21 Beispiele: MNS Sialoglycoprotein Glycophorin A (MN) und B (Ss) Ausgeprägte Homologien zwischen GpA, GpB und GpE in den ersten Exonen. Gene entwickelten sich durch Duplikation aus GpA PNAS, 1989, 86, 4619ff Nur wenige Basenaustausche unterscheiden M und N (5 in In1, Ex2 und In2) und S und s (1 in Ex4). GpB 11 Ser/Leu 1 Ser Thr Thr Gly/Glu 5 GpA Leu 1 Ser Thr Thr Glu 5 NH 2 COOH MNMN ´N´ 29 Met/Thr S s NH 2 GpA GpB GpE Exon1 Exon2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 3´-UT CTCT GTGT Proteinstart Homologe Region xx X-Over

22 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?22 Beispiele: MNS Probleme der MNS-Typisierung Protokolle zeigen Schwächen: unterschiedliche Annealing-Temperaturen für M und N benötigt Transfusion, 1993, 33, 119ff sehr lange Amplifikate Amplitype PE Ausfälle bei spezifischen Allelen In J Legal Med, 1996, 109, 216f PhänotypalterHybrid Name GP.VwMi.IA-B-A GP.MurMi.IIIB-A-B S GP.BunMi.VIB-A-B GP.HFMi.XB-A-B

23 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?23 Beispiele: MNS Probleme der MNS-Typisierung: Fall Patientin E.K. 21 Jahre Ak-Differenzierung: Anti-S, EA – PCR: NNSs Serologie: ss Hybridmolekül; AS-Variante, die spezifisches Epitop für Ak zerstört? Sequenzierung…. M M M N N M S s

24 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?24 weitere Probleme der BG-PCR: das Genprodukt erzeugt nicht direkt den Phänotyp, sondern ein umwandelndes Enzym: z.B. Lewis, P1, Ii Ringversuche, Qualitätskontrolle Kontrollproben (positiv und negativ) Inhibitoren: z. B. Kidd, Lutheran… seltene Allele: z. B. Rhesus D, FyX…

25 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?25 SerologiePCR-SSPSequenzierung Aufwand Zeit + (ca. 45 Min) ++ (ca. 2 h) +++ (ca. 4h) Kosten (AB0) ca. 4-5 ca (inhouse) ca ca. 30 (kommerziell) GOÄ (AB0)3980 5, , ,46 ( ,49 ) , ,57 Thermocycler zwischen Photoanlage ca Gelkammer, Spannungsgerät ca. 700 Sequencer ca bis Kosten und Aufwand

26 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?26 Fazit: Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand? wenn PCR-Austattung für andere Anwendungen vorhanden ist und/oder eine nennenswerte Anzahl von Problemfällen auftritt Zukunftstechnologie: Erfahrungen mit molekulargenetischer Diagnostik sammeln Kein Ersatz für Serologie

27 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?27

28 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?28 interessante Publikationen: AB0: Systematic analysis of the AB0 gene diversity within exons 6 and 7 by PCR screening reveals new AB0 allels. A. Seltsam et al. Transfusion 2003, 43; 428ff Single tube multiplex PCR-SSCP analysis distinguishes 7 common AB0 alleles and readily identifies new alleles. S. Yip Blood 2000, 95/4; 1487ff Molecular genetics of the AB0 histo-blood group system. F. Yamamoto Vox sanguinis 1995, 69; 1ff (Fortsetzung in anderen Ausgaben) Amplified product lenghth polymorphism (AFLP): a novel strategy for genotyping the AB0 blood group. G. Watanabe Human Genetics 1997, 99; 34ff Polymorphisms at the AB0 locus in subgroup A individuals. M.L. Olsson Transfusion 1996, 36; 309ff

29 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?29 interessante Publikationen: Rhesus: RHD/CE typing by polymerase chain reaction using sequence-specific primers. C. Gassner et. al. Transfusion 1997; Vol 37;1020ff Genetik des Rhesus-Blutgruppensystems. W.A.Flegel Deutsches Ärzteblatt 2007, 10; 573ff The Rh blood group system: a review. N. Avent, M. Reid Blood 2000, 95/2; 375ff Testing for the D zygosity with three different methods revealed altered rhesus-boxes and a new wek D type. P. Perco et al. Transfusion 2003, 43; 335ff Molecular basis of weak D phenotypes. F. Wagner et al. Blood 1999, 93/1; 385ff RHD positive haplotypes in D negative europeans. F. Wagner et al. BMC Genetics 2001, 2; 10ff RHD gene deletion occured in the Rhesus box. F. Wagner, A. Flegel Blood 2000, 95/12; 3662ff

30 HeymannBlutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?30 interessante Publikationen: weiteres: Differentiation of autologous ABO, RHD, RHCE, KEL, JK, and FY blood group genotypes by analysis of peripheral blood samples of patients who have recently received multiple transfusions. P. Rozman et al. Transfusion 2000, 40; 936ff Molekulargenetische Blutgruppendiagnostik. T. Müller et.al. Deutsches Ärzteblatt 2001, 98/6; 317ff DNA analysis for the Dombrock polymorphism. M. Rios et al. Transfusion 2001, 41; 1143ff Quantitative Alleles of CR1: Coding sequence analysis and comparison of haplotypes in two ethnic groups. L. Xiang J. Immunology 1999, 163; 4939ff The low-incidence MNS antigens Mv, s D, and Mit arise from single amino acid substitutions on GPB. J. Storry et al. Immunohematology 2001, 41; 269ff


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