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Abt. Genetik Inst. f. Biologie Nanostrukturen aus biologischer Sicht II Molekulare Maschinen.

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Präsentation zum Thema: "Abt. Genetik Inst. f. Biologie Nanostrukturen aus biologischer Sicht II Molekulare Maschinen."—  Präsentation transkript:

1 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Nanostrukturen aus biologischer Sicht II Molekulare Maschinen

2 Abt. Genetik Inst. f. Biologie This presentation is subject to constant change and not for use by the general public. Last years presentation of the course is available online only for participants of this course. Login, password and authorization should only be obtained from the author. Any access to this file that has not been explicitly authorized by the author will be prosecuted. The author is aware that, due to rapid changes in the field, some material may be outdated or incorrect. Mistakes can never be ruled out. The author is aware that some figures may not be correctly referenced, this will be completed with time and/or corrected during the lecture. With access to this material, users confirm that they are aware of these shortcomings and that they will not make the author liable for any mistakes. Kassel, April 2008 Wolfgang Nellen

3 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Inhalte: Isolierung von Proteinen Reinigung komplexer molekularer Maschinen Künstliche Konstruktion von Dimeren Antikörper zur Detektion von Modifikationen an Einzelmolekülen Targeting von Proteinen an Nukleinsäuren Detektion und Funktion von RNP Maschinen Die Notwendigkeit molekularbiologischer Grundlagen

4 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Molekularbiologische Nanomaschinen werden (meist) nicht de novo konstruiert oder synthetisiert. Um sie zu verstehen und letztlich manipulieren zu können, ist zuerst ihr Aufbau und ihre Funktion zu analysieren. Anders als in der Synthesechemie erfolgt dies reduktionistisch und Top-Down. Die Charakterisierung molekularer Nanomaschinen erfordert die Kenntnis molekularbiologischer Methoden und ein Verständnis dafür, was diese Methoden aussagen können und was nicht.

5 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Beispiel 1: An eine eukaryotische mRNA wird ein Linker ligiert, um die mRNA über PCR zu amplifizieren. TGGAGTTGCGGAATTCACTAGTTG.....CGAAAAA Warum geht das nicht? Wie kann man das Problem lösen?

6 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Beispiel 2: Eine molekulare Maschine produziert aus dem Substrat X in vivo das Produkt Y. Ein Kandidaten-Gen A wird im Organismus ausgeschaltet und die Reaktion von X nach Y fällt aus. Das Produkt des Gens A wird rekombinant hergestellt und die Reaktion wird in vitro durchgeführt. Die Produktion von Y findet nicht statt. Genprodukt A ist notwendig, aber nicht hinreichend für die Reaktion. Was können die Gründe dafür sein und wie kann man das herausfinden?

7 Abt. Genetik Inst. f. Biologie - hammerhead ribozyme cis cleavage Das Hammerhead-Ribozym ist eine katalytische RNA Sequenz, die ein subvirales (z.B. Viroid) Rolling-Circle-Transkript in Fragmente von Einheitslänge zerschneidet. Beispiel 3:

8 Abt. Genetik Inst. f. Biologie A A A A A G G G U U U C C 3'5' stem III stem I stem II Natural cis cleavage Die Struktur des Ribozyms wurde aufgeklärt und der Mechanismus (weitgehend) verstanden.

9 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Kann diese einfache molekulare Maschine so umgebaut werden, dass sie für andere Zwecke eingesetzt werden kann? A A A A A G G G U U U C C 3'5' stem III stem I stem II Engineered trans cleavage 3' 5' C. Hammann et al. (1997) Nucleic Acids Res. C. Hammann et al. (1999) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. Ein Teil des Ribozyms wird in vivo produziert. Der zweite Teil wird von einer zellulären Ziel- RNA gestellt. Hybridisierung des (partiellen) Ribozyms mit dem Ziel rekonstruiert die enzy- matisch aktive Struktur. Die Ziel-RNA wird zerschnitten. A A A A A G G G U U U C C 3'5' stem III stem I stem II Die minimale katalytisch aktive Sequenz wurde bestimmt. Sie kann in vitro aus drei einzelnen Molekülen zusammengesetzt werden.

10 Abt. Genetik Inst. f. Biologie A A A A A G G G U U U C C 3'5' stem III stem I stem II Natural cis cleavage A A A A A G G G U U U C C 3'5' stem III stem I stem II Engineered trans cleavage 3' 5' Die Reaktion ist allerdings nicht sehr effektiv. Was ist der Unterschied zwischen den beiden Strukturen? Welche Vermutungen kann man anstellen? Wie könnte die Reaktion verbessert werden?

11 Abt. Genetik Inst. f. Biologie R. Przybilski et al. (2005) Plant Cell Ara2 AU C 3'5' III I II L1L2 AAGAAG UGAUGA C U G A U G A A A C U C AA A GG C Scheinbar einfache Moleküle wie RNA erlauben eine Vielzahl unterschiedlicher dreidimensionaler Strukturen. Die Aufklärung dieser Strukturen und ihre Vorhersage steckt noch in den Kinderschuhen.

12 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Klassische Reinigungsmethoden der Biochemie zur Reinigung von Proteinen und Proteinkomplexen: Zellfraktionierung Gelfiltration Ultrazentrifugation Ionenaustauscher HPLC

13 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Reinigung über 6x His-Tag (6 CAU Codons an 5- oder 3-Ende) nitrilotriaceticacid (NTA)HistidinNi-NTA Coordinierung von 2 His an ein Ni 2+

14 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Das Protein Beta-Galaktosidase hat ein Molekulargewicht von 116kD. Die funktionelle Maschine ist ein Tetramer von 464kD. Die gesamte Maschine kann einfach und funktionsfähig als rekombinantes Protein gereinigt werden (Praktikumsversuch). LysatWaschschritte Eluat (dieses Gel zeigt die Aufreinigung von EriA, nicht von Beta-Gal!)

15 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Science Bridge 2007 Daniela Moll & Sara Müller PDB IX4 Fehlfunktion oder Mutation führt zu Laktoseintoleranz (besonders verbreitet im asiatischen Raum, in Südamerika und Südafrika).

16 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Nachteile von His-Tags: Endogene, Histidin-reiche Proteine binden auch an die Säule. Unspezifische Bindung von Lektinen an die Agarose-Matrix. andere ionische Wechselwirkungen können Proteinkomplexe stören Vorteile von His-Tags: kurzer Tag, meist geringe Auswirkungen auf Proteinfunktion Reinigung einfach und schnell Imidazol im Eluat

17 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Nützliche Beispiele für Proteinreinigung: Taq Polymerase Pfu Polymerase TEV Protease SP6 RNA Polymerase Vor ca. 25 Jahren reinigten Diplomanden, Doktoranden oder TAs als Gemeinschaftsaufgabe Restriktionsenzyme, weil es sie kommerziell nicht gab oder weil sie zu teuer waren. In den 90er Jahren konnte man alles kaufen. Was es nicht bei Boehringer gab, das gab es einfach nicht. Und das Geld war da, um Enzyme zu kaufen und nicht die Zeit von Wissenschaftlern zu verschwenden. Heute reinigen Diplomanden, Doktoranden oder TAs Taq, Pfu, TEV, SP6 und andere, weil es sich bei dem knappen Etat lohnt, etwas Geld zu sparen.

18 Abt. Genetik Inst. f. Biologie TAP-Tag (tandem affinity purification) The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification Oscar Puig, Friederike Caspary, Guillaume Rigaut, Berthold Rutz, Emmanuelle Bouveret, Elisabeth Bragado-Nilsson, Matthias Wilm, and Bertrand Seraphin, METHODS 24, 218–229 (2001) geeignet für gute und schnelle Reinigung komplexer Maschinen

19 Abt. Genetik Inst. f. Biologie IgG Protein A TEV CBP Protease Calmod. PAGEMS

20 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Zwei IgG Bindedomänen von Protein A (aus Staph. aureus) Calmodulin binding protein (CBP) bindet nur in Gegenwart von Ca 2+ an Calmodulin (Elution mit Chelator EGTA). Schnittstelle für (virale) TEV Protease: 7 AA Consensus Sequenz Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Ser. Komplex wird von der Matrix abgeschnitten

21 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Das Gen Rse1 wurde mit TAP getagged und ist als CBP-Rse1 Fusion am stärksten auf dem Gel vertreten. (aus Puig et al., 2001) Proteine der isolierten Komplexe werden durch SDS-PAGE aufgetrennt. Einzelne Banden werden dann massenspektrometrisch identifiziert. (TEV Protease geht im zweiten Reinigungsschritt in den Abfall! – oft wird nur ein Reinigungsschritt durchgeführt!)

22 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Variationen: Strep-Tag Basiert auf der Interaktion von Streptavidin mit Biotin (K d ~ M -1 ) Mit kombinatorischen Methoden wurde ein Streptavidinderivat Strep-tactin entwickelt, das hochaffin an ein kurzes Peptid (Strep –Tag - ersetzt Biotin) bindet: NH 2 – WSHPQFEK – COOH Das Zielprotein wird mit dem Strep-Tag fusioniert und an eine Matrix mit gekoppeltem Strep-tactin gebunden. Die Elution erfolgt mit einem Biotinderivat (Desthiobiotin). Biotin

23 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Vorsicht bei Isolierung von getaggten Proteinen mit ihren putativen Bindungspartnern! Überexpression: Die Fusionsproteine werden meist überexprimiert, die anderen Teile der molekularen Maschine aber nicht! a) viel hilft nicht viel! substoichiometrische Mengen an Bindungspartnern! b) große Mengen können zu Bindung mit unspezifischen Partnern führen. Zelluläre Reaktionen: a) Tags können in der Zelle Stressreaktionen auslösen (Stressproteine, stressbedingte, andere Interaktionspartner). b) Getaggte Proteine können andere (geringere) Affinitäten als das endogene Protein haben und konkurrieren manchmal schlechter um Interaktionspartner.

24 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Lösungsmöglichkeiten: Single Copy Insertionen in das Genom Knock out des Endogens Einfügung des Tags in das Endogen (homologe Rekombination) Alle Lösungen sind suboptimal, besonders bei molekularen Maschinen, die in geringer Anzahl in der Zelle vorhanden sind bis Zellen sind meist erforderlich, d.h. ca. 10 bis 20 l Zellkultur!

25 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Eine weitere (suboptimale) Alternative, Interaktionspartner zu identifizieren: Bindung des rekombinanten Bait-Proteins an eine Matrix (z.B. Ni-NTA). Inkubation mit einem Zellextrakt Waschen Elution des Bait-Proteins mit assoziierten Partnern Problem: in der Zelle liegt das endogene Bait-Protein im Komplex mit den Partnern vor. Das Experiment funktioniert nur, wenn der Komplex einen ausreichenden turn-over hat.

26 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Artifizielle Zusammensetzung von verschiedenen Komponenten (artifizielle Dimere). Yeast-Two-Hybrid-System Yeast-One-Hybrid-System FK506 System Lokalisation durch RNA bindende Proteine

27 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Yeast two hybrid system Deutsches Ressourcenzentrum für Genomforschung GmbH Gal4 DNA binding domain: Bait-Vector (TRP1) Gal4 Activation domain: Prey-Vector (Leu2) mit cDNA Bibliothek. basiert auf dem modularen Aufbau von Transkriptionsfaktoren

28 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Xiaoxioa Zhang, 2006

29 Abt. Genetik Inst. f. Biologie A ß-Gal Gen mit Gal4 aktiviertem Promotor (Gal1) liegt im Genom der Hefe. Ein Gal4 aktiviertes His3 ist ebenfalls im Hefegenom integriert. TRP1 liegt auf Bait Vector Leu2 liegt auf Prey Vector c-myc Epitop zum Nachweis der Bait-Expression. T7 prom. u.a. als priming site um Gal4 DBD – Bait ORF zu bestätigen.

30 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Selektion, Screening auf Interaktion zwischen Bait und Prey: Selektion auf Leu -, Trp - Medium (Test auf Anwesenheit von beiden Vektoren) Screening auf X-gal Medium für Interaktion zwischen Bait und Prey Selektion auf His - mit 3-Amino-1,2,4-trizol (3-AT) unterscheidet starke und schwache Interaktionen. Restriktionsverdau positiver Prey Vektoren (eventuelle Duplikate ausschließen). Sequenzierung der Prey Inserts, Vermutungen zu wahrscheinlichen Partnern. Rückführung der Prey Vektoren in E. coli (andere Resistenz als Bait Vektor!) Umkehrung von Prey und Bait Vektoren – Screening auf Interaktion Überprüfung, ob Prey Vektor die Induktion alleine vermitteln kann (Y1H!)

31 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Das Y2H System wird auch eingesetzt, um vermutete Interaktionen direkt zu prüfen. Das heißt, in Bait- und Prey-Vektor werden bekannte Gene eingesetzt und es wird überprüft, ob die Kombination zur Induktion von ß-Gal führt.

32 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Verschiedene Möglichkeiten, Interaktion zu bestätigen: FRET (fluorescence resonance energy transfer), Biacore, funktionelle Assays in vitro, Co-Lokalisation mit GFP / RFP getaggten Versionen in vivo (FM). Co-Immunpräzipitation Beachte: Die beschriebene Methode gilt für Proteine, die im Zellkern interagieren können. Membranproteine, extrazelluläre Proteine, Proteine in Zellorganellen sind nicht mit dieser Methode zu erfassen!

33 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Y2H System für Membranproteine PM AD DBD baitprey Ub-NUb-C

34 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Y2H System für Membranproteine PM AD DBD bait Ub-N prey Ub-C

35 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Y2H System für Membranproteine PM AD DBD bait Ub-N prey Ub-C AD DBD zum Kern

36 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Beispiel für extrazelluläre Proteine GHR (Growth hormone receptor) mit Gal4 DBD exprimiert. (GHR ist ein intrazellulärer Rezeptor, kein Membranrezeptor! GH (growth hormone) mit Gal4 AD exprimiert. GH wird sekretiert, kann in andere Zellen eindringen und an den cytoplasmatischen Rezeptor GHR binden. Der Rezeptor-Ligandenkomplex wird in den Kern transportiert. Die durch GH – GHR – Komplex verbundenen Gal4 Domänen aktivieren ß-gal.

37 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Yeast one hybrid Nutzt allein die Aktivierungsdomäne für verschiedene Analysen. Wenn unbekanntes Protein an DNA-Motiv bindet, wird Reporter aktiviert. Identifizierung von DNA-Bindedomänen. AD ? Reporterbinding site

38 Abt. Genetik Inst. f. Biologie AD DBD DNA library Die Bindestelle auf der DNA wird durch eine Bibliothek verschiedener Varianten ersetzt. Bestimmung der Consensus-Sequenz, die eine Interaktion erlaubt.

39 Abt. Genetik Inst. f. Biologie AD DBD binding site Mutagenese der DBD Bestimmung der AA Sequenz und Proteinstruktur, die Interaktion erlaubt.

40 Abt. Genetik Inst. f. Biologie In vivo Targeting von Proteinen Proteine können mit verschiedenen Tricks innerhalb der Zelle an verschiedene Orte dirigiert werden. Dort kann so die lokale Konzentration erhöht werden Proteine können bevorzugt in bestimmte Komplexe eingebaut werden. Proteine können durch Interaktionsdomäne in einen Komplex gezwungen werden.

41 Abt. Genetik Inst. f. Biologie FK506 and FKBP Durch ein externes Signal können in der lebenden Zelle zwei Proteine mit einander verbunden werden. Damit können Komplexe geschaffen werden, die auf natürliche Weise nicht vorkommen. Die lokale Konzentration eines Proteins kann an einem Ort der Zelle erhöht werden, wenn einer der Partner in der Zelle spezifisch lokalisiert ist.

42 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Die Zugabe eines Liganden führt zur Interaktion der beiden Proteine. Wenn eines an einem Ort der Zelle konzentriert ist, wird es die Konzentration des Partners an diesem Ort erhöhen.

43 Abt. Genetik Inst. f. Biologie FK506 and FKBP Tacrolimus (Prograf) Macrolide Lakton aus Streptomyceten. Verwendung als Immunsuppressor wie Cyclosporin. GD Van Duyne, et al., Science 252, 839 (1991) 2 FKBPs binden cooperativ an ein FK506 Molekül. FK506 kann wieder aus der Zelle ausge- waschen werden und die Protein- assoziation wird rückgängig gemacht.

44 Abt. Genetik Inst. f. Biologie FK506 and FKBP Durch rational design und Mutagenese wurde eine FKBP konstruiert, die ohne FK506 dimerisiert. Die Zugabe von FK506 führt bei diesem Derivat zu einer Dissoziation des Dimers.

45 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Targeting von Proteinen an spezifische RNA oder DNA Sequenzen (kleiner Exkurs in Nukleinsäure – Protein – Interaktionen). Manche Proteine erkennen spezifisch DNA Sequenzen oder Strukturen. (z.B. Restriktionsenzyme, Modifizierungsenzyme). M EcoRV Anspach, Nellen, Jeltsch Die Bindung verursacht in manchen Fällen Strukturänderungen in der Nukleinsäure-Komponente des Komplexes. Hier jedoch nur, wenn das Protein an der richtigen Bindungsstelle (Mitte) sitzt.

46 Abt. Genetik Inst. f. Biologie J. R. Horton, K. Liebert, M. Bekes, A. Jeltsch, X. Cheng Journal of Molecular Biology, 358, Structure and substrate recognition of the Escherichia coli DNA adenine methyltransferase.

47 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Molekülmitte! Bestimmung der Bindungsstelle mit SFM. Messung des Knickwinkels der DNA an korrekt gebundenem Protein. Knickwinkel an unspezifischen Binde- stellen.

48 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Manche Proteine erkennen spezifische RNA Strukturen und Sequenzen. ADAR (adenosine deaminase that acts on RNA) erkennt eine spezifische Hairpinstruktur. (Bei dieser Molekülkonstruktion ist die Orientierung durch die Gabelung erkennbar)

49 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Auswertung der SFM Daten zeigt wo und mit welcher Genauigkeit (im Vergleich zu unspezifischer Bindung) das Protein seine Erkennungssequenz im Molekül findet. Als Kontrolle werden Moleküle ohne die Erkennungssequenz/Struktur oder mit mutierten Sequenzen verwendet.

50 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Biochemisch wird der Interaktionsnachweis auch durch Gelshif Assays (EMSA = electrophoretic mobility shift assay) geführt. Biacore Experimente wurden in der Biochemie erklärt.

51 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Einschub: was versteht wer unter Nanostrukturwissenschaften? (zugegeben: mit gewisser Voreingenommenheit!) Synthesechemie physikalische Charakterisierung chemische Charakterisierung Anwendung physikalische Methodenentwicklung proof of principle experiment (Fragestellung spielt nicht unbedingt eine Rolle ) Theorie- entwicklung

52 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Beobachtung eines biologischen Mechanismus Isolierung der Komponenten (Methoden dazu!) Identifizierung/Annahme eines molekularen Mechanismus, einer molekularen Maschine reduktionistische Rekonstruktion der Maschine in vitro strukturelle Analyse (chemische/physikalische Methoden) funktionelle Analyse der Komponenten in vivo (zurück zu den Genen im Organismus) molekulare Analyse der Funktion in vivo (was kann die Maschine?) funktionelle Analyse in vitro (Assay- Entwicklung, Synthese von Komponenten, Synthese von Substraten) funktionelle Bestätigung, (Detailanalyse mit modifizierter Maschine und (chem.) modifizierten Substraten in vitro) rationales Design modifizierter Maschinen (für technische, biomedizinische Anwendung) systembiol. Komponenten- analyse, (verwandte Mechanismen Struktur-Funktion-Verhältnis, Bioinformatik) Dynamik der Maschine in vitro (Assembly/Disassembly, transiente Komponenten) Dynamik der Maschine im Systemnetzwerk (erfordert Analyse aller interagierenden Maschinen wie oben)

53 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Die Analyse biologischer Nanomaschinen erfordert die Entwicklung bzw. Adaptation chemischer, physikalischer, mathematischer und bioinformatischer Werkzeuge, die genau auf die jeweilige Problem- stellung ausgerichtet sind. Das Verständnis der biologischen Fragestellung sowie das Verständnis biologischer Systeme ist erforderlich, um zu wissen, welche chemischen/ physikalischen Methoden man sinnvoll einsetzen kann/soll. (Beispiel: Längenmessung von DNA Fragmenten nicht mit AFM sondern mit Gelelektrophorese) Ein einfaches proof-of-principle Experiment kann eine neue Methode interessant machen, löst aber nicht das Problem der spezifischen An- passung an die Fragestellung. Beispiel: die Möglichkeit, chemisch methylierte DNA mit SFM zu detektieren, löst nicht das Problem, in vivo methylierte DNA zu detektieren.

54 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Weitere Beispiele für Proteine, die spezifische RNA Strukturen oder Sequenzen erkennen: CBP PABP TBP prokaryotische RNA Polymerase virale Proteine: Tat bindet an HIV TAR RNA (Hairpin) N-Protein (Page Lambda) bindet an B-Box auf RNA (Antiterminator)

55 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Konstrukt Nr. 1: Reportergen Luziferase (für quantitative Bestimmung der Genexpression/ Translation), 5 B-Box Sequenzen im 3-UTR. Gezeigt ist die transkribierte mRNA. Luciferase AAAAA N-ProteinAgo A Konstrukt Nr. 2 Fusion von N-Protein und Testprotein (hier AgoA) mit flexiblem Linker. Expression des Fusionsproteins in Zelle. Assoziierung eines Proteins mit einer spezifischen mRNA

56 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Luciferase AAAAA AgoA wird normalerweise durch kleine RNAs (miRNAs) spezifisch an den 3 UTR einer mRNA rekrutiert und inhibiert die Translation. Das Experiment zeigt, dass die miRNA keine weitere Funktion als die eines Guides hat. AgoA kann Translation auch inhibieren, wenn es durch Protein – RNA – Interaktion an den 3 UTR gebracht wird. R. S. PILLAI, C. G. ARTUS, and W. FILIPOWICZ, (2004): RNA, 10:1518–1525. Neuere Ergebnisse zeigen jedoch, dass der künstliche Komplex in einer Ein- bahnstraße landet und und ohne die miRNA nicht reaktiviert werden kann.

57 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Proteinen-Protein oder Proteinen-Nukleinsäure-Interaktionen werden von (lokalen) Konzentrationen und Affinitäten bestimmt. Interaktionen ändern sich mit lokalen und temporären Konzentrationen Liganden können miteinander in Konkurrenz treten konkurrierende Substrate und Liganden können ihre Affinität durch Modifikationen ändern Der in vitro gemessene K D Wert sagt nicht viel über die Situation in einer Zelle aus!

58 Abt. Genetik Inst. f. Biologie µg Protein % Komplex Vergleich der Komplexbildung zwischen zwei verschiedenen dsRBDs mit einem dsRNA Substrat (EMSA, Endpunktbestimmung nach festgelegter Inkubationszeit)

59 Abt. Genetik Inst. f. Biologie HelF Dicer Dicer-dsRBD hat niedrigeren K ass als HelF aber gleichen K diss K ass 2,72 e 5 1/Ms K diss 4,4 e -3 1/s K D 19,5 nM K ass 4,7 e 4 1/Ms K diss 7,7 e -3 1/s K D 171 nM Biacore, Kinetik in Echtzeit Popova & Biaffin, 2005

60 Abt. Genetik Inst. f. Biologie HelF-dsRBD - Mg 2+ + Mg 2+ Dicer-dsRBD - Mg 2+ + Mg 2+ k ass (1,3 ± 0,5)e 4 l/Ms(4,7 ± 1,0)e 4 1/Ms(2,0 ± 0,6)e 5 1/Ms(2,7 ± 1,2)e 5 1/Ms k diss (8,0 ± 2,2)e -3 1/s(7,7 ± 2,6)e -3 1/s(2,2 ± 0,8)e -3 1/s(4,4 ± 2,2)e -3 1/s KDKD (70,6 ± 27,1) nM(171 ± 39) nM(12,1 ± 3,9) nM(19,5 ± 9,3) nM HelF-dsRBD - Mg 2+ + Mg 2+ Dicer-dsRBD - Mg 2+ + Mg 2+ k ass 2,7 e 4 1/Ms 8,2 e 4 1/Ms6,6 e 4 1/Ms k diss 3,4 e -4 1/s5,8 e -4 1/s8,9 e -4 1/s1,0n e -3 1/s KDKD 12,7 nM21,1 nM10,9 nM15,3 nM Pre-let7 dsRNA

61 Abt. Genetik Inst. f. Biologie HelF dsRBD interagiert mit pre-miRNA (Bulges) bei höherem K D als mit perfekter dsRNA. Die dsRBD von Dicer unterscheidet nicht zwischen den beiden Substraten. Der Unterschied beruht hauptsächlich auf einem Unterschied in K diss. Die Daten werden durch quantitative EMSAs und Scanning Force Microscopie (SFM) unterstützt.

62 Abt. Genetik Inst. f. Biologie ChIP: Chromatin Immune Precipitation Identifizierung von Genen, die mit bestimmten Formen von Chromatin assoziiert sind. Epigenetische Regulation erfolgt über die Remodellierung von Chromatin. Dabei werden z.B. Histonvarianten ausgetauscht, andere spezifische Proteine mit dem Chromatin assoziiert und wieder andere Proteine (z. B. Histone) posttranslational modifiziert. Die klassische Aufteilung in Euchromatin (aktiv) und Heterochromatin (inaktiv) ist nicht mehr ausreichend, es gibt weitere Formen, die durch spezifische Komplexe gekennzeichnet sind.

63 Abt. Genetik Inst. f. Biologie H3: blau H2A: gelb H2B: rot H4: grün 147 bp DNA 1,65 Windungen Core-Nucleosom Zur Erinnerung aus der Grundvorlesung

64 Abt. Genetik Inst. f. Biologie

65 Obwohl Histonmodifikationen evolutionär konserviert sind, ist für genauere Chromatinuntersuchungen eine Kartierung der Modifikationen sinnvoll. Kartierung von H3A Modifikationen in vegetativen Dictyosteliumzellen Diese Karte sagt noch nichts über eventuelle Modifikationen (und entsprechende Änderungen der molekularen Maschinen) in der Entwicklung aus!

66 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Es stehen Antikörper zur Verfügung, die einzelne Histonmodifizierungen erkennen, z.B. H3K9me2, H3K9me3. Weiterhin gibt es Antikörper gegen andere Chromatinproteine und gegen histonmodifizierende Proteine. 1. Zellen mit Paraformaldehyd behandeln, um DNA und Protein zu crosslinken. 2. Zellen mit Ultraschall behandeln, um Chromatin in Fragmente von ca. 400bp zu schreddern. 3. Immunpräzipitation mit Antikörper gegen Chromatinprotein oder Histonmodifikation. 4. Crosslink wieder aufheben und DNA aus der Chromatinpräparation isolieren. 5. PCR auf verschiedene Gene, die man in der entsprechenden Chromatin- fraktion vermutet.

67 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Chromatin wurde mit einem Antikörper gegen H3K9me2 präzipitiert (meist Heterochromatin). Es wurden drei verschiedene Stämme verwendet, zwei enthielten getaggtes Hcp Protein. Für jedem Stamm wurde die PCR Reaktion drei mal durchgeführt. Die Genloci DIRS-1 und skipper sind in der präzipitierten Heterochromatinfraktion enthalten. Das (aktive) Actin-Gen ist in der Fraktion nicht nachweisbar. Kaller et al., 2006

68 Abt. Genetik Inst. f. Biologie tri di mono ACA ACA Northern rasG Northern h h rasG h V18 Northern h V18 5 Die Trimethylierung von H3K4 korreliert mit aktiven Genen während Mono- und Di- methylierung inaktives Chromatin repräsentiert. ChIP Experimente wurden zu verschiedenen Zeiten der Dictyostelium-Entwicklung mit verschiedenen Antikörpern durchgeführt und mit PCR auf ACA, rasG und V18 Gene geprobt. Northern-Blots repräsentieren das Expressionsmuster der Gene.

69 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Wie findet man unbekannte genetische Loci, die mit einer bestimmten Chromatinkonstellation verbunden sind? Zur Erinnerung:

70 Abt. Genetik Inst. f. Biologie a) Microarrays Krankes GewebeGesundes Gewebe RNA isolieren rot markierengrün markieren mehr in krankem Gewebe gleich in beiden mehr in gesundem Gewebe

71 Abt. Genetik Inst. f. Biologie ChIP on Chip

72 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Durch ChIP on Chip werden Gene identifiziert, die in einem bestimmten Stadium mit bestimmten Chromatinproteinen besetzt sind. Ebenso können Gene identifiziert werden, die von bestimmten Transkriptionsfaktoren reguliert werden.

73 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Isolierung von genspezifischem Chromatin Griesenbeck et. al., 2004, Meth. Enzym. 375, Konstrukt Nr. 1 Zielgen wird flankiert von RS-Rekombinationsstellen und Bindestellen für das bakterielle LexA Protein. Das Konstrukt wird in das Genom der Zelle integriert. GenLexA RS Chrom. je nach Aktivitätszustand des Gens ist der Bereich mit verschiedenen Formen von Chromatin belegt. Wie findet man die Chromatinzusammensetzung eines spezifischen Gens unter verschiedenen Bedingungen?

74 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Konstrukte Nr. 2 und 3 Plasmid mit Gen für R-Rekombinase und LexA unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors. Induktion mit Galaktose führt zur Expression von R-Rekombinase und LexA mit Tap-Tag. R-RekombinaseGal1-P und LexA TAP-Tag Gal1-P

75 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Chromosom Zielgen Recombinase Über die RS-Sites rekombinieren die Flanken des Zielgens. Die Rekombinase schneidet an der Rekombinationsstelle.

76 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Es entsteht ein Ring des Zielgens mit einer RS-Site. Auf dem Chromosom verbleibt die zweite RS-site. Zielgen Chromosom

77 Abt. Genetik Inst. f. Biologie An die LexA Sites bindet das LexA Protein mit TAP-Tag. Der ganze Chromatinkomplex kann aus dem Kernlysat über Affinitätschromatografie an IgG und Calmodulin aufgereinigt werden. Als positive Kontrolle wird eine PCR mit Primern zum Zielgen, als negative Kontrolle eine PCR mit Primern zu einem anderen, Nicht-Zielgen durchgeführt. Das in-vivo assemblierte Chromatin kann über MS auf seine Zusammensetzung und z.B. auf Modifikationen der Histone untersucht werden.

78 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Problem an der Sache: Ein Gen (Dictyostelium) hat ca bp und damit etwa 10 Nukleosomen Aus 2 x 10 9 Zellen (1 Liter Kultur) können demnach theoretisch 2 x10 10 genspezifische Nukleosomen isoliert werden. Das entspricht 2 x Mol eines Proteins, das an ein Nukleosom assoziiert ist. Das entspricht 200 fM Dictyosteliumzellen wachsen auf eine Dichte von 2 x 10 6 Zellen /ml Bei einer Ausbeute von 10% muss man mit mindestens 10l Kultur anfangen, um ausreichend Material für MS zu bekommen. Bei Säugerzellen wird das richtig teuer!

79 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Neue Funktion für eine alte Maschine oder doppelte Funktion? (wie kommt man zu Funktionsvorhersagen? Wie werden sie untersucht? Wie entstehen wissenschaftliche Fragestellungen?) Sequenzähnlichkeit, besonders im katalytischen Zentrum, legt Funktion als DNA Methyltransferase nahe.

80 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Lokalisation im Zellkern (Dictyostelium) steht mit einer Funktion an der DNA im Einklang.... aber in Drosophila und in Säugern wird hauptsächlich cytoplasmatische Lokalisation gefunden.

81 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Arbeitet das Enzym als Methyltransferase? Findet man DNA Methylierung? Ist diese von der Gegenwart des Enzyms abhängig? Es gibt DNA Methylierung an wenigen Stellen (diese im Genom zu finden ist ein Problem für sich!) Methylierung ist in einer KO-Mutante reduziert (oder nicht vorhanden) und damit abhängig von der Gegenwart des Enzyms.

82 Abt. Genetik Inst. f. Biologie In vitro findet man mit dem rekombinanten Protein weder DNA Bindung (EMSA) noch DNA Methylierung.... das kann an fehlenden Co-Faktoren oder sub- optimalen Inkubationsbedingungen liegen, schließt eine Aktivität aber nicht aus. In Drosophila findet man zwei Proteine, Nup50 (Porin, cytoplasmatisch) und p68 (Helikase, nukleär) als In- teraktionspartner – dass diese für enzymatische Aktivität erforderlich sind, ist eher unwahrscheinlich – aber nicht unmöglich!

83 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Es zeigte sich dann überraschend, dass Dnmt2 aus Maus tRNA Asp methyliert. (Goll, 2006).

84 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Dnmt2 ? DNA MethRNA Meth Bunicki et al. Nucleic acids res. Vol. 32, 2453, adapted by T. Jurkowski, A. Jeltsch, Jacobs University, Bremen

85 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Welchen Mechanismus benutzt Dnmt2? C292 SAM C287 E119 R160R162 C140 C24 T. Jurkowski, A. Jeltsch, Jacobs University, Bremen Austausch aller Cys um zu sehen, ob es ein zweites gibt, das den RNA Mechanismus erlaubt.

86 Abt. Genetik Inst. f. Biologie R X R C F T ? DNA Mechanismus oder Hybrid DNA-RNA Mechanismus T. Jurkowski, A. Jeltsch, Jacobs University, Bremen

87 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Kann das Enzym beide Substrate methylieren? Hat es unterschiedliche Interaktionspartner für die verschiedenen Reaktionen? Gibt es weitere RNAs, die methyliert werden? Was ist die Funktion der DNA und/oder der RNA Methylierung? 1.Dnmt2 in Fisch für Leber, Hirn und Retina-Entwicklung notwendig. 2.Dnmt2 in Drosophila für längeres Leben und gutes Kletterverhalten. 3.Dnmt2 in Dictyostelium für Immobilität eines Retrotransposons. Was haben diese Phänotypen gemeinsam? weitere biochemische, biophysikalische, genetische und zellbiologische Experimente.

88 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Ein paar SFM Anwendungen... Kraftmessungen der einfachsten Art: Nukleinsäure bindet unspezifisch an Mica (Glimmer = Schichtsilikat) Nukleinsäure bindet ebenfalls un- spezifisch an Siliziumcantilever. Bei Entfernung vom Substrat wird die Nukleinsäure gespannt und es treten messbare Kräfte auf.

89 Abt. Genetik Inst. f. Biologie melting-phase F P Bonin et al., Nucleic Acids Res., 30, e81, (2002) L 0 : kraftfreies Anheben der Nukleinsäure F P : Streckung bei B-S Transition L P : kraftfrei Extension der S-Form Kraft-Abstandskurve

90 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Plateau-Force F P ist abhängig vom GC Gehalt der Nukleinsäure F P ist bei RNA größer als bei DNA Bonin et al., Nucleic Acids Res., 30, e81, (2002)

91 Abt. Genetik Inst. f. Biologie S-Value: L P / L 0 Dehnbarkeit der S-Form (relativ zur ursprünglichen Länge des Moleküls in B- bzw. A Konformation. Bonin et al., Nucleic Acids Res., 30, e81, (2002)

92 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Fortgeschrittene Kraftspektroskopie Fragestellung: der Transkriptionsfaktor expG bindet an Sequenzen in verschiedenen Promotoren. Unterscheiden sich diese Bindungen in ihrer Stärke?

93 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Fortgeschrittene Kraftspektroskopie Funktionalisierung der Spitze (hier DNA an PEG), Protein auf der Mica-Oberfläche. Bartels et al, 2003 Unbinding force (rupture) wird gemessen. Die verschiedenen Promotoren zeigen dabei keine signifikanten Unterschiede.

94 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Die Bindungsstärke kann über die Loading rate genauer bestimmt werden. Die Loading rate ist definiert als: Federkonstante (nN/nm) x retraction velocity (nm/s) = nN/s Bei hoher Loading rate spielt die thermodynamische off-rate der Protein – DNA Interaktion eine größere Rolle und die Bindung an die ver- schiedenen Promotoren unter- scheidet sich signifikant. Kraftspektroskopie liefert zu- sätzliche Informationen, die EMSA Experimente ergänzen. Bartels et al, 2003

95 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Ein paar Ideen... Können Kräfte der enzymatischen Aktivität gemessen werden? Hybridisierung von RNAs an Oberfläche und Cantilever Spannen der RNA Zugabe einer Helikase und Aktivierung mit ATP Entwindung und Relaxation des Cantilevers

96 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Bindung der dsRNA an Oberfläche und Cantilever Spannen der RNA Zugabe von Dicer und Aktivierung mit Mg 2+ Schnitt und Relaxation des Cantilevers Können Kräfte der enzymatischen Aktivität gemessen werden?

97 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Detektion von DNA Modifikationen an Einzelmolekülen: Der Traum von der Einzelmolekül-Sequenzierung. U. Bockelmann, et al. Phy. Rev. Lett. 79, 4489 (1997). G-C: 20pN A-T: 9pN Resolution limit: 10 basepairs

98 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Antikörper gegen 5-Methylcytosin als Modell 1 2 Cantilever Crosslinker Antibody ssDNA Methyl- cytidine Aldehyde glass Force (pN) Distance (nm) 12 Der Abstand zwischen zwei Bindungsereignissen an einem Antikörper kann durch Kraft- spektroskopie gemessen werden. R. Zhu, P. Hinterdorfer, pers. Mitteil.

99 Abt. Genetik Inst. f. Biologie R. Zhu, P. Hinterdorfer, pers. Mitteil. 5 methylcytosines separated by 4 nucleotides DNA - methylcytosine

100 Abt. Genetik Inst. f. Biologie In einem gegebenen einzelsträngigen DNA Fragment kann der Abstand zwischen Methylcytosinen mit einer Auflösung von einem Nucleotid ge- messen werden. Spezifische Antikörper gegen normale Nucleotide können hergestellt werden. branched crosslinker Antibody fragment against specific nucleoside ssDNA Nucleoside Cantilever 1 Force (pN) Distance (nm) 12 2 Die Auflösung und Detektions- weite kann durch monovalente Antikörperfragmente und durch verzweigte Crosslinker ver- bessert werden. R. Zhu, P. Hinterdorfer, pers. Mitteil.

101 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Arrays von x 200 Cantilevers könnten auf einem 2 x 2cm Chip Proben gleichzeitig messen.

102 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Ob diese Methode eine Alternative zu anderen Sequenzierverfahren bieten wird, ist eher fraglich. Für die SNP Analyse (single nucleotide polymorphism) oder die Detektion modifizierter Nucleotide könnte sie jedoch einsetzbar werden. Aber: DNA Modifizierung geht bei Clonierung oder bei PCR Amplifikation verloren. Die gezeigten Ergebnisse entstanden an synthetischen Molekülen mit synthetisch plazierte Methylcytosinen!

103 Abt. Genetik Inst. f. Biologie Das waren Nanostrukturen aus (molekular)biologischer Sicht.


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