Die Präsentation wird geladen. Bitte warten

Die Präsentation wird geladen. Bitte warten

Diagnostik von Pockenviren 1 Ausbildungsmaterial des Robert Koch-Instituts 06/01/2004 Bund-Länder-AG Szenarien bioterroristischer Anschläge und Abwehrmaßnahmen.

Ähnliche Präsentationen


Präsentation zum Thema: "Diagnostik von Pockenviren 1 Ausbildungsmaterial des Robert Koch-Instituts 06/01/2004 Bund-Länder-AG Szenarien bioterroristischer Anschläge und Abwehrmaßnahmen."—  Präsentation transkript:

1 Diagnostik von Pockenviren 1 Ausbildungsmaterial des Robert Koch-Instituts 06/01/2004 Bund-Länder-AG Szenarien bioterroristischer Anschläge und Abwehrmaßnahmen

2 Gliederung Einleitung klinisches Bild Eingruppierung des Erregers der Pocken Diagnostik und Differentialdiagnostik –Elektronenmikroskopie –Nachweis von Nukleinsäuren –Erregeranzucht Probenahme und Versand Diagnostik aus Patientenmaterial und aus Umweltproben Liste der Laboratorien zur Pockendiagnostik 2

3 Pocken Erreger: Variola-Virus Inkubationszeit 12 bis 14 Tage ( Tage) Hohe Viruskonzentrationen in Vesikeln und Krusten Übertragung über Tröpfchen, hohe Viruskonzentration in Saliva Letalitätsrate ca. 30 % (Variola major) bzw. ca. 1 % (Variola minor) 3

4 Pocken als Biowaffe 1754/67 Briten schenkten Indianern in Nordamerika Pockenvirus-verseuchte Decken > 50% der Mitglieder der betroffenen Stämme starben 4

5 Tag 3 Tag 5Tag 7 Pocken - klinisches Bild 5

6 Klassifizierung von Chondropockenviren (Pockenviren der Vertebraten) OrthopoxvirenVariola, Vaccinia, Affenpocken, Kuhpocken, Kamelpocken AvipoxvirenGeflügelpocken, Kanarienpocken CapripoxvirenZiegenpocken, Schafspocken, Lumpy Skin Disease LeporipoxvirusMyxomatose ParapoxvirusOrf, Pseudokuhpocken SuipoxvirusSchweinepocken MolluscipoxvirusMolluscum contagiosum Yatapoxvirus Tanapocken, Yabapocken 6

7 Orthopockenviren VirusInfektionen bei Wirtsbereich VariolaMensch eng VacciniaBüffel, Kuh, Mensch, Schwein, breit Kaninchen, natürlicher Wirt? AffenpockenMenschenaffen, Affen, Mensch breit natürlicher Wirt: Eichhörnchen (?) KuhpockenKarnivoren, Kuh, Mensch, Ratte breit natürlicher Wirt: Gerbils, Nagetiere (?) KamelpockenKamel eng EctromeliaMäuse, natürlicher Wirt (Wühlmäuse?) eng WaschbärpockenWaschbär (racoon)breit? WühlmauspockenWühlmäuse (vole) eng Uasin-Gisha-PockenPferd, natürlicher Wirt? mittel TaterapockenTatera kempi (Gerbilart) eng 7

8 Übersicht über die Laboruntersuchungen Elektronenmikroskopie –orientierende Schnelldiagnostik (ca. 30 min.) –Unterscheidung zwischen Herpesviren, Para- und Orthopockenviren Nachweis von Nukleinsäuren/Sequenzierung –Unterscheidung zwischen verschiedenen Orthopockenviren (innerhalb von 24 h) Virusanzucht –Nachweis der Vermehrungfähigkeit (Asservierung für weitergehende Untersuchungen) 8

9 Herpesvirus Orthopockenvirus Parapockenvirus EM-Differenzierung von Pockenviren und Herpesviren 9 Quelle Fotos: RKI, H. Gelderblom

10 EM-Differenzierung Verschiedene Aspekte der Orthopockenviren (OPV) OPV: mit VirushülleOPV: M-FormOPV: M-Form+C-Form Quelle Fotos: RKI, H. Gelderblom 10

11 Elektronenmikroskopie Fixierung des Probenmaterials (z.B. mit 4 % Formaldehyd in 0,05 M HEPES-Puffer pH 7,0 oder PBS) Außen-Dekontamination des Fixier-Röhrchens (z.B. mit 10 % Formaldehyd oder 2,5 % Natrium- Hypochlorid oder 2 % Peressigsäure) Negativkontrastierung (stabile, stark adhäsive Trägernetze; als Kontrastmittel parallel Phosphorwolframsäure und Uranylazetat oder Ammoniummolybdat) 11

12 Elektronenmikroskopie Aufarbeitung von Proben für den Versand Quelle: RKI Quelle Fotos: RKI 12 Probenahme durch den verantwortlichen Arzt (1, 2) Pockenbläschen mit Schere, Pinzette o.ä. öffnen (1) bzw. Schorf mit Pinzette entnehmen (2) Vesikelprobe auf Objektträger, direkt oder mit Tuberkulin- spritze (1) Lufttrocknen (1, 2) Inaktivierung (1, 2) bruchsicherer Container (1, 2) Sterile Umverpackung (1, 2) 1 Versand von Vesikelflüssigkeit 2 Versand von Vesikeln / Schorf

13 Elektronenmikroskopie Aufarbeitung von Proben für den Versand - Grid-Methode EM-Trägernetz mit dunklen Ober- Seite für 2-3 sec auf die Bläschenflüssigkeit abdrücken, pro Läsion 2-3 Grids Lufttrocknen in der Pinzette Inaktivierung mit 4% Formaldehyd in PBS oder HEPES-Puffer Versand: - beschriftetes Röhrchen - sterile Umverpackung Quelle Fotos: RKI 13

14 Nachweis von Nukleinsäuren Inaktivierung des Probenmaterials (z.B. mit Lysispuffer % Guanidiniumchlorid) Außen-Dekontamination des Fixier-Röhrchens (z.B. mit 10 % Formaldehyd oder 2,5 % Natrium-Hypochlorid oder 2 % Peressigsäure) Probenaufbereitung/Isolierung der DNA (Protease, AL-Puffer) Nachweis von Nukleinsäuren –Consensus PCR (Vertreter der Orthopoxviridae OPV) –Differenzierung des Variola-Virus von anderen OPV (Sequenzierung z. B. crmB-Gen, ATI-Gen, HA-Gen oder validierte Varila-spezifische PCR ) 14

15 Erregeranzucht Nur aus nicht-inaktiviertem Probenmaterial Nur in Laboratorien der Sicherheitsstufe 4 (BSL4) Eine Differenzierung erfolgt nach Präparation der Virus-DNA über PCR mit Sequenzierung und phylogenetischer Analyse 15

16 Gewinnung klinischer Proben Zusammenfassung der Möglichkeiten zur Probenahme: EM: 1) getrockneter Abstrich auf Objektträger, fixiert mit 4 % FA 2) Spritze: Spritzen-Inhalt in Röhrchen mit wenig 4% FA 3) Spritze: Übertragung in ein Röhrchen, fixiert mit 4 % FA 4) Direkter Abklatsch (Grid) fixiert mit 4 % Formaldehyd PCR: Aliquot in Reaktionsröhrchen (in einer Glove-Box) Benötigtes Material zur Probenahme: Schutzausrüstung Pinzette, Schere, Spritze, Objektträger, Grid (je nach Technik) Versandröhrchen (z.B. Einfrierröhrchen) Stoßsichere, auslaufsichere Umverpackung (mit Beipackzettel) Zur Fixierung/Desinfektion : 4 % Formaldehyd in PBS oder HEPES-Puffer (EM) Lysispuffer AL, Puregene Kit, o. ä. (PCR) Desinfektionsmittel zur Außendekontamination 16

17 Gewinnung von Umweltproben (1) Probenahme durch Einsatzkräfte (z.B. Feuerwehr) Sicherstellung, dass kein explosiver Stoff / kein chemischer Kampfstoff enthalten ist Risikoanalyse: –Fall 1: geschlossenes Behältnis –Fall 2: geöffnetes Behältnis (a) Feststoff, (b) Pulver, (c) Flüssigkeit –Fall 3: Freisetzung Schutzkleidung anlegen Probenahme Außendesinfektion des Probenahmegefäßes Stoßfeste Umverpackung Beschriftung der Umverpackung (Fundort, Datum, Uhrzeit) 17

18 Gewinnung von Umweltproben (2) Schwarzbereich: durch Probe kontaminierter Bereich –Schutzanzug mit positivem Druck –Raum verschließen –Desinfektion der Oberflächen (Entscheidung, ob und wann ) Graubereich: Übergangsbereich (Schleuse) –Außendesinfektion des Probenahmegefäßes –weitere Verpackung des Probenmaterials –Desinfektion der Schutzanzüge etc. Weißbereich: nicht-kontaminierter Bereich –Betreten nur nach Desinfektion der Schutzkleidung –Nur steril verpackte Probe 18

19 Probentransport Schnellstmöglicher Probentransport zum Labor (Wenn anderweitig nicht sichergestellt, muss der Transport per Polizeistreife oder Hubschrauber erfolgen.) Information des Ansprechpartners im Labor Verpackung der Probe laut Sicherheitsbestimmungen und Anforderungen an die Diagnostik Lückenloses Probennahme- und Transportprotokoll (inklusive Personen, Probenzustand und Zeiten) Persönliche Übergabe durch vorab bestimmten Kurier (Übergabeprotokoll wird momentan erstellt) Sofortige Bestätigung des Probeneingangs durch das Labor an den behandelnden Arzt oder zuständigen Amtsarzt 19

20 z.B. Pulver, Erdprobe, Wasser, Abklatsch etc. Umweltprobe Klinische Probe z.B. Rachenabstrich; Blut; Vesikelinhalt; Krusten Pockenvirusdiagnostik 1. Fixierung für EM 2. Inaktivierung für PCR 3. Asservierung für Anzucht Negativkontrastierung (Differentialdiagnose zu VZV) Orthopockenviren Anzucht in Zellkultur Differenzierung mit PCR Sequenzierung PCR Orthopocken- und Variola-spezifische Primer bzw. Sonden Probenasservierung Vorbereitung von drei Probengefäßen: Die Schritte 1–3 werden bei klinischen Proben direkt bei der Abnahme von Patienten und bei Umweltproben in einer Glove Box durchgeführt. Eine Anzucht von Pockenerregern ist nur in BSL-4-Laboratorien möglich. Nach Fixierung bzw. nach Inaktivierung können die Proben unter BSL-1/-2-Bedingungen weiter bearbeitet werden. Untersuchung im EM ¬­® Klinische Probe: Verdacht Umweltprobe: Verdacht Klinische Probe: bestätigt Umweltprobe: begründeter VerdachtUmweltprobe: bestätigt positivbeide positiv 20

21 Verdacht auf Pockenviruserkrankung: Elektronenmikroskopischer Nachweis eines Orthopockenvirus aus klinischer Probe Bewertungskriterien für Untersuchungen auf humane Pockenviren in klinischem Material (1) 21

22 Bewertungskriterien für Untersuchungen auf humane Pockenviren in klinischem Material (2) Bestätigt positiv: Positive Orthopockenvirus-/Variola-PCR aus klinischem Material und Bestätigung mit validierten molekularen Methoden (validierte PCR, Sequenzierung) oder Elektronenmikroskopischer Nachweis eines Orthopockenvirus aus klinischem Material und Bestätigung mit validierten molekularen Methoden (PCR, Sequenzierung) (Anzucht von Pockenviren aus klinischem Material und Bestätigung von Variola mit validierten molekularen Methoden (PCR, Sequenzierung)) 22

23 Bewertungskriterien für Untersuchungen auf humane Pockenviren in Umweltproben Verdacht: Elektronenmikroskopischer Nachweis eines Orthopockenvirus aus einer Umweltprobe begründeter Verdacht: PCR positiv für Orthopockenviren bzw. für Variola; Differenzierung der Viren mit validierten molekularen Methoden (PCR, Sequenzierung, Stammbaumanalyse) Bestätigung: Anzucht von Pockenviren zum Nachweis der Vermehrungs- fähigkeit in Zellkultur und Bestätigung von angezüchtetem Variolavirus mit validierten molekularen Methoden (PCR, Sequenzierung, Stammbaumanalyse) 23

24 Vorschlag für Laboratorien zur Pockendiagnostik 24

25 Diagnostische EM-Laboratorien mit überprüfter Expertise* 25 * Expertise geprüft von der DVV


Herunterladen ppt "Diagnostik von Pockenviren 1 Ausbildungsmaterial des Robert Koch-Instituts 06/01/2004 Bund-Länder-AG Szenarien bioterroristischer Anschläge und Abwehrmaßnahmen."

Ähnliche Präsentationen


Google-Anzeigen