Die Präsentation wird geladen. Bitte warten

Die Präsentation wird geladen. Bitte warten

24. März 2010 Forum Biotech, Analytica 2010 Dr. Hanswilly Müller Sensovation 1.

Ähnliche Präsentationen


Präsentation zum Thema: "24. März 2010 Forum Biotech, Analytica 2010 Dr. Hanswilly Müller Sensovation 1."—  Präsentation transkript:

1 24. März 2010 Forum Biotech, Analytica 2010 Dr. Hanswilly Müller Sensovation 1

2 24. März 2010 Gliederung Einführung, Begriffserklärung, Motivation Geräte-Evaluierung und Technologie Vergleich Colorimetrische Fluoreszenz Detektion Multiplex Modell – Assay Colorimetrischer Assay zum Nachweis von Grippeviren Assay-Entwicklung und Validierung an Patientenproben 2

3 24. März 2010 Gliederung Einführung, Begriffserklärung, Motivation Geräte Evaluierung und Technologie Vergleich Colorimetrische Fluoreszenz Detektion Multiplex Modell – Assay Colorimetrischer Assay zum Nachweis von Grippeviren Assay Entwicklung und Validierung an Patientenproben 3

4 24. März 2010 Multiplexing Trend zur personalisierten Medizin erfordert bessere, mehr und häufigere diagnostische Untersuchungen Simultane Messung verschiedener Parameter in einer Probe Proteine, DNA Etablierte Multiplexing Techniken: Planare Microarrays hoher Dichte: DNA arrays Bead-basierter Ansatz mit Durchflusszytometrie (bis zu100-plex) Unser Ansatz: Planare Microarrays in 96 Well Platten Arrays geringer Dichte (z.B. 9 bis ca. 144 Spots pro Microarray) Ideal für den Nachweis von Protein-Markern, Genotypisierung Colorimetrische- und Fluoreszenz Detektion Multiplexed Diagnostics

5 24. März 2010 Multiplexen in der Diagnostik Multiplexing ist sinnvoll wenn: Das diagnostische Panel vernünftig zusammengestellt ist, zielgerichtet und effizient ist Detektion verschiedenen Virus-Stämme, mehrere Marker einer Krankheit etc… Über das Gesundheitssystem abgerechnet werden kann Nicht schwieriger handhabbar ist als ein Einzeltest Z.B. ein Assay in einer 96-well-Mikroplatte Er zusätzlichen Nutzen für ein Labor bringt Z.B. Kostenersparnis Laborarbeit oder Reagenzien Hürden: Verfügbarkeit einer robusten, kompakten und erschwinglichen Detektion Spotting Technologie 5

6 24. März 2010 CLAIR ® : Colorimetric Array Imaging Reader für Microarrays CCD-basierter Imaging Reader Geeigent für IVD Eigenständiges Gerät Mit eingebautem Rechner, Kontroll-Software, Touch- Screen und integrierter Spot Auswertung Für die quantitative Auswertung von Microarrays Spot Größen von 50 – 500 µm Schnelle Bildaufnahme Ca. 2 Minuten pro Mikroplatte Flexible Probenformate 96-well Platte, Strip-well Platte, Objektträger

7 24. März CLAIR – Anwendungsbeispiel HPV Genotypisierungs-Assay Zur Differenzierung von onkogenen / harmlosen HP-Viren Grippe-Viren Genotypisierungs Assay Zur Diagnose unterschied- licher Grippe-Viren

8 24. März 2010 Gliederung Einführung, Begriffserklärung, Motivation Geräte-Evaluierung und Technologie Vergleich Colorimetrische Fluoreszenz Detektion Multiplex Modell – Assay Colorimetrischer Assay zum Nachweis von Grippeviren Assay Entwicklung und Validierung an Patientenproben 8 Durchgeführt in Zusammenarbeit mit VTT, Turku, Finland

9 24. März 2010 Multiplexed Assay Multiplexed diagnostischer DNA assay Microarray Matrix von Genen / Oligonucleotiden Multiplexed diagnostischer Immunoassay Microarray Matrix von Antikörpern / Antigenen Protein Array, „Multiplexed Sandwich ELISA“

10 24. März 2010 „Arrays in Well“ Plattform mit fluorogenen oder colorimetrischen Substraten (C) 2009 Sensovation AG10 Arrays in Well (AIW) Microarrays in 96-Well Platten Multi-Analyt basierte Bioassays im einfachen und vertrauten Mikroplatten Format

11 24. März 2010 Vorteil eines Multiplexed Assays

12 24. März 2010 Prinzip: Array in Well

13 24. März Prinzip von Fluoreszenz, Verstärkte Fluoreszenz und Colorimetrie Fänger Antikörper Antigen Markierter Antikörper Direkte Fluoreszenz Protein Array, „Multiplexed Sandwich ELISA“

14 24. März H202H202 HRP Fänger Antikörper Antigen Markierter Antikörper CY3 Verstärkte ( Amplified ) Fluoreszenz (Tyramide) Protein Array, „Multiplexed Sandwich ELISA“ Prinzip von Fluoreszenz, Verstärkte Fluoreszenz und Colorimetrie

15 24. März 2010 TMB 15 H202H202 HRP TMB Fänger Antikörper Antigen Markierter Antikörper Colorimetrie Protein Array, „Multiplexed Sandwich ELISA“ Prinzip von Fluoreszenz, Verstärkte Fluoreszenz und Colorimetrie

16 24. März 2010 Technologie Vergleich anhand eines Modell Assays : CLAIR vs. Confocal Scanning Färbe Technik: Colorimetrie im Vergleich zu direkter Fluoreszenz im Vergleich zu verstärkter Fluoreszenz Reader Technologie: CLAIR  Tecan LS400 =>CCD-Imager Laser Scanner Modell Assay Adenovirus Hexon Protein (Virus Antigen) Verdünnungsreihe von 156 ng/ml bis ng/ml, plus Leerwert Multiplexed Sandwich ELISA Doppelbestimmung Jedes Näpfchen enthielt eine Anordnung von 3 x 3 Spots Array Layout

17 24. März 2010 CLAIR Konfokaler Scanner, Bilder Direkte FluoreszenzVerstärkte Fluoreszenz Colorimetrische Detektion

18 24. März 2010 Verstärkte Fluoreszenz (Cy3) ist die empfind- lichste Methode, Detektionsgrenze: ng/ml Direkte Fluoreszenz (Dy633) ist etwa 2x weniger empfindlich TMB Assay Detektions- grenze: ng/ml. Schlussfolgerung : Cy3/TECAN doppelt so empfindlich wie Dy633/TECAN welche doppelt so empfindllich ist wie TMB/CLAIR. Vergleich Färbung / Reader CLAIR Konfokaler Scanner, S / N

19 24. März 2010 CLAIR Konfokaler Scanner, Diskussion Empfindlichkeit: Colorimetrischer TMB-Assay ist nur ca. 2-mal bzw. 4-mal weniger empfindlich als direkte / verstärkte Fluoreszenz Dynamischer Bereich: Colorimetrischer Assay hatte eine sehr gute Linearität über 2 Größenordnungen Verstärkte Fluoreszenz hatte einen geringeren dynamischen Bereich als die colorimetrische Messung Direkte Fluoreszenz hatte eine gute Linearität über 3 Größenordnungen Beachte: Dieser Vergleich beinhaltet Färbetechnik, kombiniert mit Detektionstechnik: High End Forschungs - Scanner ( Fluoreszenz ) gegenüber einem Routine-Reader ( Colorimetrie )

20 24. März 2010 Gliederung Einführung, Begriffserklärung, Motivation Geräte Evaluierung und Technologie Vergleich Colorimetrische Fluoreszenz Detektion Multiplex Modell – Assay Colorimetrischer Assay zum Nachweis von Grippeviren Assay Entwicklung und Validierung an Patientenproben 20 Durchgeführt in Zusammenarbeit mit VTT, Turku, Finland

21 24. März 2010 Multiplexed Virus Assay Test von Grippeviren Multiplexed Analyse von 7 Grippeviren Sandwich ELISA Assay Colorimetrisches Auslesen mit CLAIR Reader Verdünnungen von Virus-Infiziertem Zell- Lysat Array Layout Adenovirus, Respiratory Syncytial Virus (RSV), Influenza A (InfA), Influenza B (InfB), Parainfluenza 1 (PIV1), Parainfluenza 2 (PIV2) und Parainfluenza 3 (PIV3)

22 24. März 2010 Multiplexed Virus Assay, Bilder Schlussfolgerung: Mit dem multiplex Assay konnten alle 46 analysierten Virus- Proben detektiert und korrekt klassifiziert werden. Das Auslesen und die Auswertung mit CLAIR war schnell und einfach. Die Analytik ist einfach automatisierbar. Beispiele

23 24. März 2010 Analyse klinischer Proben Analyse der genannten Grippeviren in 88 klinischen Patientenproben mittels eines multiplex Assay Die Patientenproben wurden parallel analysiert Mittels colorimetrischer TMB-Detektion (CLAIR) Mittels verstärkter Fluoreszenz (Laser Sanner, TECAN) Die Pateintenproben waren zuvor mittels TR-FIA getestet worden: 44 Proben waren Antigen-negativ, 44 waren Antigen-positiv: Adenovirus, Respiratory Syncytial Virus (RSV), Influenza A (InfA), Influenza B (InfB), Parainfluenza 1 (PIV1), Parainfluenza 2 (PIV2) und Parainfluenza 3 (PIV3)

24 24. März 2010 Analyse klinischer Proben Jeder Fänger-Antikörper wurde 6 mal gespottet: Drei Spots mit hoher Antikörper- Dichte Drei Spots mit geringerer Antikörper- Dichte  Erhöhung des dynamischen Bereichs, da einige Proben mit hoher Antigen Konzen- tration Kreuzreaktion zeigten Positive Kontrollen in allen vier Ecken Dienen auch als Referenz- Spots für das Grid bei der automatischen Auswertung Array Layout

25 24. März 2010 Analyse klinischer Proben, Bilder Direkter Vergleich TMB/CLAIR und Cy3/TECAN

26 24. März 2010 Analyse klinischer Proben, Ergebnisse Colorimetrische Detektion (CLAIR) lieferte vergleichbare Ergebnisse zu dem Fluoreszenz-Test ( verstärkte Fluoreszenz ), gemessen mit dem Tecan LS400 Tecan / Fluoreszenz charakterisierte 82 von 88 Proben richtig (gemessen an der TR-FIA Referenzmethode) CLAIR / Colorimetrie charakterisierte 77 von 88 Proben richtig (gemessen an der TR-FIA Referenzmethode) Alle falsch charakterisierte Proben waren PIV 3 Proben, die offenbar mit der Zeit degradiert waren (TR-FIA Messungen fanden mehrere Wochen früher statt) Mit Fluoreszenz wurden die Proben gerade über dem “Cut-Off” gemessen Mit Colorimetrie wurden die Proben gerade unter dem “Cut-Off” gemessen  Die genaue Antigen-Konzentration zum Zeitpunkt dieses Experi- mentes ist unbekannt und könnte unter dem “Cut-Off” gelegen haben

27 24. März 2010 Zusammenfassung Colorimetrische Detektion ist im Ergebnis vergleichbar mit Fluoreszenz-Detektion (verstärkte Fluoreszenz) Vergleichbare Empfindlichkeit und Linearität Fluoreszenz Assays können einfach in colorimetrische Assays “umgebaut” werden Colorimetrische Assays und die dafür notwendigen Geräte sind weniger komplex und preisgünstiger als die entspechenden Fluoreszenz-Geräte Colorimetrische Assays sind ideal für die Routineanalytik in klinischen Labors, Veterinärmedizin und Lebensmittel- analytik

28 24. März 2010 Danke für Ihr Interesse!


Herunterladen ppt "24. März 2010 Forum Biotech, Analytica 2010 Dr. Hanswilly Müller Sensovation 1."

Ähnliche Präsentationen


Google-Anzeigen