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Grundlagen der Durchflusszytometrie. Gliederung -Was ist ein Durchflusszytometer? -Teile eines Durchflusszytometers - Flüssigkeitssystem - Optik - Elektronik.

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Präsentation zum Thema: "Grundlagen der Durchflusszytometrie. Gliederung -Was ist ein Durchflusszytometer? -Teile eines Durchflusszytometers - Flüssigkeitssystem - Optik - Elektronik."—  Präsentation transkript:

1 Grundlagen der Durchflusszytometrie

2 Gliederung -Was ist ein Durchflusszytometer? -Teile eines Durchflusszytometers - Flüssigkeitssystem - Optik - Elektronik - Computer -Instrumentsettings -Beispielsmessung

3 Diese Partikel haben etwas gemeinsam Algae Chromosomes Blood cells Protozoa Einige ihrer Eigenschaften können mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemessen werden..

4 Was ist ein Durchflusszytometer? Grundlegend ist ein Durchflusszytometer ein automatisiertes Fluoreszenzmikroskop. (Erste Prototypen sahen auch so aus)

5 Das automatisierte Mikroskop Waste Detector & Counter Sample Diese einfache Darstellung zeigt das Grundprinzip eines Durchflusszytometers: Zellen werden in einer Durchflussküvette an einer Mikroskopoptik vorbei geführt.

6 Das Durchflusszytometer

7 Welche Parameter können gemessen werden?  die relative Zellgrösse (Forward Scatter - FSC)  die Granularität oder innere Komplexität (Side Scatter - SSC)  die Fluoreszenzintensität (FL1, FL2, up to FL X)

8 Teile eines Durchflusszytometers Flüssigkeitssystem –Liefert einen konstanten Hüllflüssigkeitsstrom –Transportiert die Probe in die Küvette –Fokussiert die Zellen im LASER-Strahl Optik –Fokussiert das Anregungslicht –Sammelt das emittierte Licht Elektronik –Wandelt Lichtsignale in elektrische Signale um –Sendet die Signale zum Auswerterechner Computer – Stellt Daten graphisch dar – Kontrolliert die „Instrument Settings“

9 Charakteristiken von FSC und SSC Coherent lightsource (488 nm) Forward scatter Cell size (488 nm) Side scatter Granularity (488 nm) Forward scatter (FSC)  gemessen entlang der Achse des einfallenden Lichtes  proportional zur Zellgrösse / Zelloberfläche (nur bei runden Zellen) Side scatter (SSC)  gemessen im 90° Winkel zum einfallenden Licht  proportional zur Zellkomplexität und Granularität

10 Beispiel: Blut Forward scatter Side scatter Granulozyten Debris Lymphozyten Monozyten

11 Fluoreszenz =488 nm Excitation light =530 nm Emission light  Die Fluorochrome absorbieren die Energie des Anregungslichtes.  Die absorbierte Energie wird abgegeben als:  Schwingungsenergie und Wärme  Emission eines Photons mit grösserer Wellenlänge ( = geringere Energie)

12 Fluoreszenzintensität FITC Relative fluorescence intensity Number of Events FITC

13 Hydrodynamische Fokussierung Sheath Sample

14 Optische Filter SP 500 LP 500 BP500/80 Longpass Shortpass Bandpass

15 Octagon Detection System SSC PE PE-Cy7 FITC PerCP-Cy / LP

16 Elektronik  Wandelt optische Signale (Photonen) in elektronische Signale (Spannungspulse) um  Digitalisiert die Signale  Analysiert die -Höhe [Height (H)], -Weite [Width (W)] und die -Fläche [Area (A)] des Spannungspulses  Übermittelt die Daten an den Auswerterechner

17 Entstehung eines Spannungspulses Voltage Laser Laser Laser t t t

18 Auswertung eines Spannungspulses Time (µs) Voltage Pulse Area (A) Pulse Height (H) Pulse Width (W) 400

19 Schwellenwert (Threshold) Der Schwellenwert gibt die minimale Signalintensität an, die an dem jeweiligen Kanal erreicht werden muss. Alle Signale mit geringerer Intensität werden nicht dargestellt.

20 Zusammenfassung  Während die Zellen den LASER-Strahl passieren, werden Spannungspulse am Photomultiplier generiert  Das Signal wird verstärkt  Die Elektronik digitalisiert das Signal mit einer Frequenz von 10MHz  Nur Signale, die den gewünschten Schwellenwert überschreiten, werden analysiert und aufgezeichnet  Die Daten werden letztlich zum Analyserechner übermittelt, der mit dem Zytometer verbunden ist

21 Instrumentsettings Die exakten Werte für PMT-Spannung und Schwellenwert hängen von der Applikation (Zelltyp, Färbemethoden und Probenvorbereitung) und dem jeweiligen Durchflusszytometer (optische Eigenschaften) ab Darstellung der Daten in linearer oder logarithmischer Skala ist in der Regel durch die Anwendung bedingt Die exakten Werte für PMT-Spannung und Schwellenwert hängen von der Applikation (Zelltyp, Färbemethoden und Probenvorbereitung) und dem jeweiligen Durchflusszytometer (optische Eigenschaften) ab Darstellung der Daten in linearer oder logarithmischer Skala ist in der Regel durch die Anwendung bedingt

22 Datenspeicherung Alle Daten werden direkt in eine interne Datenbank gespeichert. Jeder Plot ist mit dem entsprechenden Datenfile verbunden. Jedes Tube trägt eine Kopie der Instrumentsettings, die während der Aufzeichnung aktiv waren. Daher gibt es keine speziellen Speicherungsbefehle in der Software. Jede Aktion wird in der Datenbank aufgezeichnet. Beim Beenden und Neustarten der Software wird das letzte Experiment exakt an der Stelle geöffnet an der es verlassen wurde. Alle Daten werden direkt in eine interne Datenbank gespeichert. Jeder Plot ist mit dem entsprechenden Datenfile verbunden. Jedes Tube trägt eine Kopie der Instrumentsettings, die während der Aufzeichnung aktiv waren. Daher gibt es keine speziellen Speicherungsbefehle in der Software. Jede Aktion wird in der Datenbank aufgezeichnet. Beim Beenden und Neustarten der Software wird das letzte Experiment exakt an der Stelle geöffnet an der es verlassen wurde.

23 Darstellung der Daten 1 1) Histogramm - ein Parameter, der die Fluoreszensintensität als Häufigkeitsverteilung dargestellt

24 Event 1 Event 2 Event 3 FSCSSCFL1FL Listmode file FL1-H FL2-H Darstellung der Daten 2 2) Dotplot (Punktwolkendarstellung) - zwei Parameter werden auf der x- und y-Achse dargestellt

25 Enough theory of flow! Nun ein Beispiel aus dem Laboralltag: Enough theory of flow! Nun ein Beispiel aus dem Laboralltag:

26 Aufgabe: Bestimmung des prozentualen Anteils an CD4+, CD3+ und CD8+ Zellen im Vollblut Material Milzzellen aus der Maus Methode Drei-Farben-Immunfluoreszenz Preparation Färben von frisch isolierten Milzzellen Färbung Ungefärbte Kontrolle Einzelfärbungen für CD3-FITC, CD4-PE und CD8-APC, um die passenden Instrumentsettings zu bestimmen Material Milzzellen aus der Maus Methode Drei-Farben-Immunfluoreszenz Preparation Färben von frisch isolierten Milzzellen Färbung Ungefärbte Kontrolle Einzelfärbungen für CD3-FITC, CD4-PE und CD8-APC, um die passenden Instrumentsettings zu bestimmen

27 Einstellung der FSC- und SSC-Spannung FSC und SSC sind optimal eingestellt, wenn die zu untersuchende Population (z.B. Lymphozyten) von allen anderen Populationen zu unterscheiden ist Der Schwellenwert des FSC wird so eingestellt, dass Debris überwiegend von der Datenauswertung ausgeschlossen wird FSC und SSC sind optimal eingestellt, wenn die zu untersuchende Population (z.B. Lymphozyten) von allen anderen Populationen zu unterscheiden ist Der Schwellenwert des FSC wird so eingestellt, dass Debris überwiegend von der Datenauswertung ausgeschlossen wird

28 Parameter (I) FSC und SSC  Abhängig vom Zelltyp und Zustand (naiv oder aktiviert)  Abhängig von der Präparationsmethode (z.B. Ficoll, Fixierungsmethode)  Werden normalerweise genutzt, um die zu untersuchende Population für weitere Untersuchungen zu definieren FSC und SSC  Abhängig vom Zelltyp und Zustand (naiv oder aktiviert)  Abhängig von der Präparationsmethode (z.B. Ficoll, Fixierungsmethode)  Werden normalerweise genutzt, um die zu untersuchende Population für weitere Untersuchungen zu definieren

29 Parameter (II) Fluoreszenzkanäle (FL1, FL2, FL3, FLX)  Abhängig von der Färbung (Konjugat, Antikörper, Propidium Jodid für DNA-Färbung, etc.)  Meistens dient die Fluoreszenz als Marker für die statistische Analyse Fluoreszenzkanäle (FL1, FL2, FL3, FLX)  Abhängig von der Färbung (Konjugat, Antikörper, Propidium Jodid für DNA-Färbung, etc.)  Meistens dient die Fluoreszenz als Marker für die statistische Analyse

30 „Gating“: Bestimmen der gewünschten Population

31 „Gating“ Selektive Analyse definierter Zellpopulationen Gates können manuell oder automatisch durch die Software gesetzt werden Zu kleine Gates können zum Verlust von Zellpopulationen führen Zu grosse Gates können die Zahl unerwünschter Zellen erhöhen Selektive Analyse definierter Zellpopulationen Gates können manuell oder automatisch durch die Software gesetzt werden Zu kleine Gates können zum Verlust von Zellpopulationen führen Zu grosse Gates können die Zahl unerwünschter Zellen erhöhen

32 Einstellung der Fluoreszenzsettings A) Einstellen der PMT-Spannung Probe: ungefärbte Kontrolle Die gemessene Fluoreszenz wird als unspezifische Autofluoreszenz betrachtet. Die Lymphozytenpopulation wurde vorher im FSC und SSC „gegated“. B) “Quadrantengating” Traditionell werden Quadranten benutzt um die 4 möglichen Populationen in einem 2-Farben- Experiment zu definieren. Bei Vielfarbenexperimenten ist diese Art des „Gatings“ nicht die optimale Lösung.

33 „Quadrantengating“ FL1-H FL2-H FITC + PE FITC PE negative Q2 Q4 Q3 Q1

34 Fluoreszenzüberstrahlung 650nm700nm500nm550nm600nm Relative Intensität Wellenlänge (nm) FL1 530/30 FL2 585/42

35 FITC-Kompensation Detektor - … % Signal 650nm700nm 500nm 550nm600nm Relative Intensität Wellenlänge (nm) FL1 530/30 FL2 585/42

36 Lowering the FITC- population is achieved by Subtracting a percentage of FITC- intensity from the affected PE-channel nm700nm500nm550nm600nm FL1 530/30 FL2 585/42 Relative Intensity … because 25% of the FITC-signal are actually detected in the PE channel... Wavelength (nm) FITC-Kompensation

37 Zusammenfassung FSC und SSC werden so eingestellt, dass die Population gut von anderen Populationen zu unterscheiden ist Die gewünschte Population wird „gegatet“ Die PMT Spannungen der Fluoreszenzkanäle werden mit der ungefärbten Kontrolle eingestellt Einzelfärbungen werden eingemessen um Fluoreszezüberstrahlungen zu kompensieren


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