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Immunologisches Labor Refresher Kurs zur Vorbereitung eines Kolloquiums bei der KV 1.

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Präsentation zum Thema: "Immunologisches Labor Refresher Kurs zur Vorbereitung eines Kolloquiums bei der KV 1."—  Präsentation transkript:

1 Immunologisches Labor Refresher Kurs zur Vorbereitung eines Kolloquiums bei der KV 1

2 2 Facharztweiterbildung Nuklearmedizin Weiterbildungsinhalt: Erwerb von Kenntnissen, Erfahrungen und Fertigkeiten in... … der nuklearmedizinischen in-vivo- und in-vitro-Diagnostik unter Verwendung von organ-/zielgerichteten Radiodiagnostika … … der Radiochemie und der gebietsbezogenen Immunologie und Radiopharmakologie

3 3 Juristische Voraussetzungen Laborrichtlinien KBV 5/1994 Nuklearmediziner : RIA (entspr. Weiterbildung/Zeugnis) Bei NON-RIA : Prüfung Fachkommission Schriftwechsel KBV 2005 Immunologische Parameter unabhängig von Methode ( RIA, LIA, FIA etc ) durch Nuklearmediziner abzurechnen, falls Weiterbildung vorliegt

4 4 Fachliche Aspekte Laborkolloquium von der KV eingesetztes Gremium 3-4 Mitglieder ( mind. 1 Laborarzt ) Fragenkatalog Angaben von Kollegen

5 Inhalt Kolloquium Immunologische Methoden RIA, LIA, FIA Immunologisches Testprinzip Interpretation der Ergebnisse Rili-BÄK Qualitätsmanagement Qualitätssicherung

6 41. Jahrestagung des BDN Immunologische Messmethoden Nürnberg, September 2012 In Kooperation mit: Euro-Labor-Freiburg 6 Dr. Hermann Butz, Drei-G-Consulting

7 Empfohlene Literatur Sokolowski/Wood: Radioimmunoassay in Theorie und Praxis: nur noch antiquarisch erhältlich L. Thomas: Labor und Diagnose: 7. Auflage, gebraucht ca. 100 bei Amazon, Kapitel 52.1: Immunchemische Techniken (S – 1936) Packungsbeilagen der jeweiligen Teste Ausführlicheres Vortragsscript: Euro-Labor oder 7

8 Klassisches Anwendungsgebiet von Immunoassays: Hormonanalytik Hormonanalytik von Körperflüssigkeiten (in-vitro, ohne Probenaufbereitung) Spezifischer Nachweis von Hormonkonzentrationen in Anwesenheit vieler anderer, zum Teil sehr ähnlicher Moleküle: hohe Spezifität gefordert Schlüssel-Schloss-Prinzip von Antigen-Antikörper-Reaktionen Nachweis extrem niedriger Konzentrationen (10 -6 bis mol): hohe Signalstärke gefordert = hohe spezifische Aktivität des Signalträgers gefordert 125 J (später weitere Signalträger: Enzyme, Fluoreszenz, Luminesz.) Erster Immunoassay: R. Yalow/S. Berson (1959): Nobelpreis 1977 Insulin-RIA, (kompetitiver IA, homogen) Heutiger Standard-IA: Sandwich-Immunoassay (nicht-kompetitiver IA, heterogen) 8

9 Teilnehmer eines Immunoassay Antigene (Analyte = zu bestimmende Substanz): Hormone (Proteohormone, Steroidhormone,...), Medikamente,.... Antikörper: Y-Form mit Fab-Teil (Antigenspezifisch) und Fc-Teil (Speziesspezifisch), bindet spezifisch an Ziel-Antigene Antigene und Antikörper bilden Ag-Ak-Komplexe nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip Ag-Ak-Reaktionen folgen dem Massenwirkungsgesetz (Ag-Ak) Ag + Ak Ag-Ak Affinitätskonstante K = (Ag) x (Ak) hohe Affinitätskonstante = feste Bindung von Ag und Ak Hohe Analytische Sensitivität möglich 9

10 Bestandteile eines (Sandwich-)Immunoassays Gesucht: variable Konzentration eines Ag Messbar über: konstante Zahl von Ak im Immunoassay Markierung des Ak Ak Überschuss Komplexbildung: Ag + Ak Überschuss Ag-Ak + Ak Trennung von gebundener Phase Ag-Ak und freier Phase Ak gesuchte Antigenkonzentration = Menge des Signals in der gebundenen Phase = Ag-Ak 10

11 Moderne, heterogene IA: Vorwegnahme der Trennung von freier und gebundener Phase durch Kopplung eines Ak an eine Festphase Festphase (Solid Phase): Röhrchenwand Kaverne einer Mikrotiterplatte Kügelchen Magnetische Partikel, Latex-Partikel, Glas-Partikel,.... Je kleiner und beweglicher die Festphase, umso kürzer die Inkubationszeit Wash Freie Phase Gebundene Phase 11

12 Markierung eines Ak mit geeignetem Signalträger Signalgeber (Tracer): Radioaktivität ( 125 J, 3 H: Gammacounter; 1-10 Minuten) Enzyme (farblose Substrate farbige Produkte: Photometer (Lambert-Beersches Gesetz; Min.)) Lumineszenz (Acridiniumester, Luminol, (Enzym: Alkalische Phosphatase katalysiert Lichtreaktion): Luminometer; sec.) Fluoreszenz (Fluorophore: Fluorometer; 1 sec.) Wash 12

13 Signalarten _ Farblose Substrate Farbige Produkte 10 – 20 Minuten RIA, IRMA, __ E MPO = Meerettich-Peroxidase, AP = Alkalische Phosphatase, ADP = Adamantyl-Dioxetan-Phosphat, AE = Acridinium-Ester, TR = Tris-(2,2-bipyridyl)-Ruthenium AE H 2 O 2 + NaOH EIA, IEMA LIA, ILMA AE + Licht (1-2 sec.) _ LIA, ILMA TR Anregende Elektrode Licht Meist manuelle EIA: viele Hersteller (Fujirebio, DSL,....) Direkte CL: Siemens-Centaur, Abbott Elektro-CL: Roche (MPO) 125 J Wash Gammacounter 13

14 Signalarten _ Farblose Substrate Farbige Produkte 10 – 20 Minuten RIA, IRMA, __ E MPO = Meerettich-Peroxidase, AP = Alkalische Phosphatase, ADP = Adamantyl-Dioxetan-Phosphat, AE = Acridinium-Ester, TR = Tris-(2,2-bipyridyl)-Ruthenium AE H 2 O 2 + NaOH EIA, IEMA LIA, ILMA AE + Licht (1-2 sec.) _ LIA, ILMA TR Anregende Elektrode Licht Meist manuelle EIA: viele Hersteller (Fujirebio, DSL,....) Direkte CL: Siemens-Centaur, Abbott Elektro-CL: Roche (MPO) 125 J Wash Gammacounter Keine der verschiedenen Signalarten ( 125 J, Enzym, Fluorophor, Luminophor) ist in der Summe aller Eigenschaften der anderen eindeutig überlegen 14

15 EIA oder LIA oder FIA vs. RIA Was unterscheidet einen RIA von den anderen IA NUR die Signalart, sonst ist alles gleich !!! Wer eine RIA abarbeiten und die Ergebnisse im klinischen Kontext bewerten kann, der kann auch mit nicht-Radioaktiven IA korrekt umgehen. Welche konstruktiven Varianten von IA (RIA, EIA, LIA, FIA) gibt es ? Nicht-Kompetitive IA vs. Kompetitive IA = IRMA vs. RIA 15

16 Bestandteile eines IA, Ablauf Standard-Sandwich-Immunoassay: IRMA (Immun-RadioMetrischer Assay) Ak 1 an Festphase Ak 2 mit Signalträger ( 125 J, andere Signalträger: analog) Inkubation mit Probenantigenen Waschschritt Messung Wash 16

17 Darstellung der Ag-Ak-Komplexe Y Y Vereinfachte Darstellung Bisherige Darstellung 17

18 Y Y Y Y Y SP-AK 1 im Überschuss Signal-AK 2 im Überschuss Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) Wash Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung 18

19 Y Y Y Y Y SP-AK 1 im Überschuss Signal-AK 2 im Überschuss Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) Analyt im Unterschuss Wash Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Relative untere Nachweisgrenze: 1 Linear und proportional ansteigende Standardkurve (Steigung: 1) 19

20 Y Y Y Y Y SP-AK 1 im Überschuss Signal-AK 2 im Überschuss Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) Analyt im Unterschuss Wash Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Relative untere Nachweisgrenze: 1 Linear und proportional ansteigende Standardkurve (Steigung: 1) 20

21 Y Y Y Y Y SP-AK Signal-AK 2 Analyt Wash Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Maximales Signal Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) Relative untere Nachweisgrenze: 1 Linear und proportional ansteigende Standardkurve (Steigung: 1) 21

22 Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell: Störung eines IRMA: High-Dose-Hook-Effekt Y Y Y Y Y SP-AK 1 im Unterschuss Signal-AK 2 im Unterschuss Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) Analyt im hohen Überschuss Wash Maximales Signal Bei extremen Analytkonzentrationen (z.B. hCG bei Blasenmole) steigt die Zahl von einzelnen AK-Ag-Komplexen (vgl. Heidelberger Kurve) = eine steigende Anzahl von Ag-Signal-Ak- Komplexen wird weggewaschen. Das Mess-Signal (SP-AK1-Ag- Signal-Ak2) sinkt trotz steigender Analytkonzentration. Ein Signal (hier: relatives Signal 3) kann zu mehreren Konzentrationen gehören (relative Konzentration 3 oder zu einer extrem hohen Konzentration x). Hilfe: Wash nach SP-Ak 1 -Ag-Inkubation oder Verdünnungen herstellen und vermessen x 22

23 Sandwich-Technik für alle Antigene geeignet ? NEIN !!! Bestimmung von Steroiden oder Schilddrüsenhormonen ? Östradiol: MG 272,3 Da T4: MG 776,9 Da Sehr kleine Analyte haben nur 1 Epitop, Bindung eines zweiten (Signal-) Antikörpers an den Analyten ist nicht möglich andere Assaytechnik ist gefordert Markierung des Antigens (Assay-Ag: Ag ) kompetitive Immunoassays Solid Phase 23

24 Kompetitive Immunoassays: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Y Y Y Y SP-AK Gesucht: Konzentration des Analyten in der Probe via Ag Prinzip: Proben-Antigen und markiertes Assay-Antigen konkurrieren um die Bindungsplätze am Antikörper und belegen sie entsprechend ihrer Konzentrationsverhältnisse. Das Messsignal ist am höchsten, wenn kein Probenantigen vorhanden ist. Mit steigender Anzahl von Probenantigen werden immer mehr markierte Assay- Antigene verdrängt und das Messignal sinkt: Konzentrationsbestimmung möglich! 24

25 Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Y Y Y Y SP-AK Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) SP-AK im Unterschuss Markierter Analyt im Überschuss 25

26 Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Y Y Y Y SP-AK Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) Wash SP-AK im Unterschuss Markierter Analyt im Überschuss 26

27 Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Y Y Y Y Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) SP-AK im Unterschuss Markierter Analyt im Überschuss Analyt in der Probe Konzentrationsverhältnis: 2 : 6 = 1 : 3 Ag-ProbeAg-Assay 27

28 Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Y Y Y Y SP-AK im Unterschuss Markierter Analyt im Überschuss Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) Analyt in der Probe Konzentrationsverhältnis: 2 : 6 = 1 : 3 Wash Relative untere Nachweisgrenze: 2 (!) 28

29 Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Y Y Y Y SP-AK im Unterschuss Markierter Analyt im Überschuss Analyt in der Probe Konzentrationsverhältnis: 18 : 6 = 3 : Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) Flache, nicht-lineare Standardkurve (= schlechtere Präzision) Relative untere Nachweisgrenze: 2 (!) Wash 29

30 Sandwich-IA vs. kompetitiver IA = IRMA vs. RIA Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) IRMA: Relative untere Nachweisgrenze: 1 Linear und steil ansteigende Standardkurve (= sehr gute Präzision) Breiter Messbereich (Ak 1,2 -Erhöhung) mit sehr guter Präzision RIA: Relative untere Nachweisgrenze: 2 (!) flache, nicht-lineare Standardkurve (= schlechtere Präzision) eingeschränkter Messbereich mit akzeptabler Präzision 30

31 Zusammenfassung: Sehr gute Sensitivität Sehr gute Präzision Sehr weiter Messbereich Sehr gute Spezifität Sehr schnell Gute Sensitivität Gute Präzision Weiter Messbereich Gute Spezifität Schnell Ist der Analyt ein Hapten: Kompetitiv = RIA Ist der Analyt groß genug: Nicht-Kompetitiv = IRMA RIAs unterscheiden sich (eigentlich) nicht von anderen IA Verschiedene (+/- gleichwertige) Signalarten 31

32 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit ! 32

33 33 Rili-BÄK Aktuell = 4. Richtlinie der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen (gültig seit ) Sie gilt für jeden, der analytische Messungen durchführt und stellt eine Vielzahl komplexer Anforderungen an das Management und das Personal in Laboren und Praxen! Der heutige Fokus liegt auf Teil A und Teil B1 der Rili-BÄK: Teil A betrifft die grundlegenden Anforderungen an die Qualitätssicherung Teil B1 die QS quantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen

34 34 Rili-BÄK Teil A der Richtlinie fordert die Erstellung eines umfassenden Qualitätsmanagement-Systems zur Regelung der folgenden Bereiche: 1.Struktur (Organigramm, Zuständigkeiten…) 2.Technische- und Personelle Ressourcen (Räume, Ausrüstung…) 3.Präanalytik (Gewinnung, Transport, Vorbereitung Probenmaterial…) 4.Analytik (Standardisierte Arbeitsanleitungen, Validierte Untersuchungsverfahren…) 5.Postanalytik (technische und medizinische Validation, Laborbericht…) 6.Qualitätsmanagementhandbuch (QM-Ziele & Strategien, Arbeitsprozesse…) 7.Dokumentenlenkung (Versions-Nr., Freigabe, Schulung…) 8.Umgang mit Beschwerden (Dokumentation, Korrekturmaßnahmen…) 9.Fremdlaboratorien (Versanddokumentation, Kontrolle…) 10.Fehlerhaften Untersuchungsergebnisse (Verfahrensbeschreibung…)

35 35 Rili-BÄK Teil B1 der Richtlinie beschriebt die interne und externe QS Siehe hierzu: Auszug aus der Tabelle B 1 a

36 36 Rili-BÄK Interne QS: alle vom medizinischen Laboratorium durchgeführten quantitativen Untersuchungen unterliegen der internen Qualitätskontrolle

37 37 Rili-BÄK Teil B1 der Richtlinie beschriebt die interne und externe QS Siehe hierzu: Auszug aus der Tabelle B 1 a

38 38 Rili-BÄK Konsequenz bei nicht Einhaltung der zulässigen relativen Abweichung Überschreitet ein Kontrollprobeneinzelmesswert die vorgegebene Fehlergrenze, ist das Messverfahren vorläufig gesperrt; es muss nach der Ursache der Abweichung gesucht und diese beseitigt werden; die Messung wird wiederholt. Überschreitet der relative quadratischen Mittelwert der Messabweichung (QMDM) einer Kontrollprobe, den in Tabelle B1a-c/Sp3 angegebenen oder den laborintern ermittelten Wert, ist das Untersuchungsverfahren für weitere Messungen von Patientenproben zu sperren. Das Messverfahren kann erst dann wieder freigegeben werden, wenn die Funktionsfähigkeit des Verfahrens durch geeignete Maßnahmen festgestellt wurde. Alle QS- Maßnahmen müssen lückenlos dokumentiert werden.

39 39 Rili-BÄK Externe Qualitätssicherung (Ringversuche) Für alle durchgeführten Analysen, der in Tabelle B1 a-c aufgeführten Parameter, ist die Teilnahme an einem Ringversuch pro Quartal Pflicht. Die vollständige Richtlinie (incl. Tabelle B1a bis c) erhalten Sie auf der Homepage der Bundesärztekammer unter Für weitere Informationen und/oder die Zusendung des Scripts können Sie gerne Frau Regina Clotten (QMB euro-labor) unter der Adresse: kontaktieren.

40 40 Kooperations-Möglichkeiten Kostenbetrachtung Reduzierung der Vergütung für SD-Parameter (GKV-EBM) 2000 und 2006 um je !!! Herstellungskosten für Immunologische Parameter konstant / steigend (Personal, Geräte, Miete...) Rili-BÄK – Zusätzliche Kosten!!! Teil A: Qualitätsmanagemant (Handbuch etc.) Teil B: Interne + Externe Qualitätskontrollen z.B SD-Patienten/Tag >> 20 – ,- Kosten/Jahr

41 41 Kooperations-Möglichkeiten Optimale Teste für SD-Parameter (unabh. Von Methode, Preis etc.) > Eigenständiges Immunologisches Labor > Mehrere Analysegeräte für unterschiedliche SD-Parameter > Kontroll-Möglichkeiten für jeden einzelnen einsendenden Arzt > Auswahl nach aktueller Qualität (Genauigkeit, Reproduzierbarkeit, Ablauf etc.) Q u a l i t ä t v o r W i r t s c h a f t l i c h k e i t

42 42 Kooperations-Möglichkeiten Immunologische Laboratorium-Untersuchung I Ärztlich Untersuchungsentscheidung (Indikation) III Laboratoriumsmedizinische Analyse II Präanalytik IV ärztliche Beurteilung

43 43 Kooperations-Möglichkeiten Immunologische Laboratorium-Untersuchung Indikationsstellung, Präanalytik (Schritt I+II) Qualitätsprüfung (Korrelation mit anderen Parametern, Verlauf, Therapiebeeinflußung etc.) Befundung (Schritt IV) Immunologische Laboratorium-Untersuchung in eigener Praxis

44 44 Kooperations-Möglichkeiten Immunologische Laboratorium-Untersuchung Technische Leistung (Schritt III) = Laboratoriumsmedizinische Analyse (zentral erbracht) Immunologische Laboratorium-Untersuchung im ausgelagertem Labor

45 45 Kooperations-Möglichkeiten Eigenständiges Abrechnen Modell Immunologie Freiburg Erste von der KV genehmigte überörtliche Leistungserbringergemeinschaft zur Erbringung immunologischer Untersuchungen in Deutschland Schritte I, II, IV in eigener Praxis Schritt III in Rahmen Immunologie Freiburg

46 46 Kooperations-Möglichkeiten eigenständiges Abrechnen Systematik des §15 Abs. 3 BMW-Ä: Die Leistung wird als eigene Leistung desjenigen Arztes abgerechnet, wenn Schritt 1, 2, 4 in eigener Praxis und Schritt 3 in Rahmen der Leistungserbringergemeinschaft Immunologie Freiburg im Auftrag des Arztes durch einen anderen erbracht wird. Mitgliedschaft in Immunologie Freiburg bedeutet eigenständige Leistungserbringung!


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