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Unter einer Sequenzanalyse versteht man ein technisches Verfahren zur Ermittlung der Abfolge von Nukleotiden in einem DNA-Abschnitt. lat.: sequi = folgen.

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Präsentation zum Thema: "Unter einer Sequenzanalyse versteht man ein technisches Verfahren zur Ermittlung der Abfolge von Nukleotiden in einem DNA-Abschnitt. lat.: sequi = folgen."—  Präsentation transkript:

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2 Unter einer Sequenzanalyse versteht man ein technisches Verfahren zur Ermittlung der Abfolge von Nukleotiden in einem DNA-Abschnitt. lat.: sequi = folgen ? ?? ? ? ???? ? ? ? ?? ? ? ?? ? ? ???? ? ? ? ?? ?

3 Unter einer Sequenzanalyse versteht man ein technisches Verfahren zur Ermittlung der Abfolge von Nukleotiden in einem DNA-Abschnitt. lat.: sequi = folgen ? ?? ? ? ???? ? ? ? ?? ? ? ?? ? ? ???? ? ? ? ?? ? In der Regel verläuft diese in 4 Abschnitten Vervielfältigung Denaturierung Kettenabbruch- verfahren Gelelektrophorese

4 Vervielfältigung Zu untersuchendes Stück der DNA wird mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) vervielfältigt. 1. Schritt: Erwärmen 94 o C

5 Vervielfältigung 2. Schritt: Zugabe von zwei verschiedenen Primern und Abkühlen auf 60 o C. 94 o C

6 Vervielfältigung 2. Schritt: Zugabe von zwei verschiedenen Primern und Abkühlen auf 60 o C. 94 o C 60 o C

7 Vervielfältigung 2. Schritt: Zugabe von zwei verschiedenen Primern und Abkühlen auf 60 o C. 60 o C

8 Vervielfältigung 3. Schritt: Erhitzen auf 78 o C und Zugabe von Nucleotiden. 60 o C 78 o C Beobachtung: Die Taq-Polymerase synthetisiert ausgehend von den beiden Primer den komplementären Strang

9 Vervielfältigung 3. Schritt: Erhitzen auf 78 o C und Zugabe von Nucleotiden. 78 o C Vorgang startet nun erneut mit Schritt 1 aber mit dem Unterschied, dass nun gleichzeitig 2 DNA-Abschnitte dupliziert werden.

10 Vervielfältigung 1. Schritt: Erwärmen (Wiederholung …) 94 o C usw.

11 Vervielfältigung Nach einigen Durchläufen der PCR bei denen sich die Menge an DNA jeweils verdoppelt, liegen ausreichende Mengen der zu untersuchenden DNA vor.

12 Denaturierung 1. Schritt: Erwärmen um die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren zu lösen 94 o C 2. Schritt: Zugabe von Natronlauge um eine erneute Zusammenlagerung zu verhindern. Die DNA liegt nun endgültig in Form von Einzelsträngen vor, die sich nicht mehr zusammenlagern können. 3. Schritt: Zugabe eines einzelnen Primers, der eine radioaktive Markierung besitzt und sich nur an den codogenen Strang anlagert. Der komplementärer Strang wird nicht benötigt! A TG

13 Hybridisierung A TG Damit sind nun automatisch drei Nucleotide bekannt. A TC Zum Versuchsansatz werden nun die Taq-Polymerase, die 4 Nucleotide und ein Abbruchnucleotid hinzugefügt. A T C G A Bei einem Abbruchnucleotid wird am 3`- Ende der Desoxyribose die OH-Gruppe durch ein Wasserstoffatom ersetzt. Dadurch entsteht eine Didesoxyribose. An ihr ist keine Kettenverlängerung mehr möglich. A H OH A H H Adenosinnukleotid Adenosinabbruchnukleotid dA ddA 200 : 1 Man gibt dA im Überschuss zu damit eine Kettenverlängerung möglich wird. Nur dA würde immer einen Kettenabbruch bei der ersten Thyminbase bewirken.

14 Kettenabbruch- reaktion A TG Ablauf: 1. Variante A TC

15 Kettenabbruch- reaktion A TG Ablauf 1. Variante A TC

16 Kettenabbruch- reaktion A TG Ablauf 1. Variante A TC

17 Kettenabbruch- reaktion A TG Ablauf: 1. Variante A TC A Weitere Kettenverlängerung ist nicht möglich, daher erfolgt ein Kettenabbruch. Trennung der komplementären Stränge durch Temperaturerhöhung.

18 Kettenabbruch- reaktion Ablauf: 1. Variante A TC A TG A

19 Kettenabbruch- reaktion A TG Ablauf: 2. Variante A TC

20 Kettenabbruch- reaktion A TG Ablauf 2. Variante A TC

21 Kettenabbruch- reaktion A TG Ablauf 2. Variante A TC

22 Kettenabbruch- reaktion A TG Ablauf 2. Variante A TC

23 Kettenabbruch- reaktion A TG Ablauf 2. Variante A TC

24 Kettenabbruch- reaktion Ablauf 2. Variante A TC A TG A

25 Kettenabbruch- reaktion Ablauf 2. Variante A TC A TG A

26 Kettenabbruch- reaktion A TG Ablauf: 3. Variante A TC

27 Kettenabbruch- reaktion A TG Ablauf 3. Variante A TC

28 Kettenabbruch- reaktion A TG Ablauf 3. Variante A TC

29 Kettenabbruch- reaktion A TG Ablauf 3. Variante A TC

30 Kettenabbruch- reaktion A TG Ablauf 3. Variante A TC

31 Kettenabbruch- reaktion Ablauf 3. Variante A TC A TG

32 Kettenabbruch- reaktion Ablauf 3. Variante A TC A TG

33 Kettenabbruch- reaktion Ablauf 3. Variante A TC A TG

34 Kettenabbruch- reaktion Ablauf 3. Variante A TC A TG

35 Kettenabbruch- reaktion Ablauf 3. Variante A TC A TG

36 Kettenabbruch- reaktion Ablauf 3. Variante A TC A TG

37 Kettenabbruch- reaktion Ablauf 3. Variante A TC A TG A

38 Kettenabbruch- reaktion Ablauf 3. Variante A TC A TG A

39 Kettenabbruch- reaktion Ablauf 3. Variante A TC A TG A Ergebnis nach 3 Durchläufen A TG A A TG A Nun wird das Experiment mit den restlichen 3 Abbruchnucleotiden (ddT, ddG,ddC) durchgeführt.

40 A TG AA TG A A TG A A TGCC A TG A TG CA TG C A TG T A TG T A TG T A TG G A TG G A TG G Abbildung aller möglichen Sequenz- Abschnitte. Könnte man diese optisch nach ihrer Länge sortieren ergäbe sich die gesuchte DNA-Sequenz!

41 G C ATGT A G C GC TA A TC A TG AA TG A A TG A A TGC A TG G A TG TC A TG A TG T A TG G A TG CA TG G A TG C A TG T

42 Gelelektrophorese Bei der Gelelektrophorese werden die Bruchstücke nach Ihrer Länge aufgetrennt und durch ihre Radioaktivität sichtbar gemacht. Das Gel muss so engporig sein, dass der Unterschied in der Wanderungsgeschwindigkeit schon bei einem Nucleotid sichtbar wird. (Polyacrylamidgel). In die Taschen werden nun die Abschnitte, die mit einer dd-Abbruch- Base erhalten wurden eingefüllt ddA- Stücke ddT- Stücke ddC- Stücke ddG- Stücke Spannung wird angelegt DNA-Abschnitte wandern aufgrund der negativen Ladung der Phosphatgruppen zur Anode (+-Pol).

43 ddA- Stücke ddT- Stücke ddC- Stücke ddG- Stücke Gelelektrophorese Bei der Gelelektrophorese werden die Bruchstücke nach Ihrer Länge aufgetrennt und durch ihre Radioaktivität sichtbar gemacht. Das Gel muss so engporig sein, dass der Unterschied in der Wanderungsgeschwindigkeit schon bei einem Nucleotid sichtbar wird. (Polyacrylamidgel). In die Taschen werden nun die Abschnitte die mit einem dd-Stopper erhalten wurden eingefüllt DNA-Abschnitte wandern aufgrund der negativen Ladung der Phosphatgruppen zur Anode (+-Pol). Spannung wird angelegt

44 Gelelektrophorese Bei der Gelelektrophorese werden die Bruchstücke nach Ihrer Länge aufgetrennt und durch ihre Radioaktivität sichtbar gemacht. Das Gel muss so engporig sein, dass der Unterschied in der Wanderungsgeschwindigkeit schon bei einem Nucleotid sichtbar wird. (Polyacrylamidgel). In die Taschen werden nun die Abschnitte die mit einem dd-Stopper erhalten wurden eingefüllt DNA-Abschnitte wandern aufgrund der negativen Ladung der Phosphatgruppen zur Anode (+-Pol). Da die Primer radioaktiv markiert sind können die DNA-Fragmente über einen Röntgenfilm sichtbar gemacht werden. Spannung wird angelegt ddA- Stücke ddT- Stücke ddC- Stücke ddG- Stücke

45 ddA- Stücke ddT- Stücke ddC- Stücke ddG- Stücke Gelelektrophorese Bei der Gelelektrophorese werden die Bruchstücke nach Ihrer Länge aufgetrennt und durch ihre Radioaktivität sichtbar gemacht. Das Gel muss so engporig sein, dass der Unterschied in der Wanderungsgeschwindigkeit schon bei einem Nucleotid sichtbar wird. (Polyacrylamidgel). In die Taschen werden nun die Abschnitte die mit einem dd-Stopper erhalten wurden eingefüllt DNA-Abschnitte wandern aufgrund der negativen Ladung der Phosphatgruppen zur Anode (+-Pol). Da die Primer radioaktiv markiert sind können die DNA-Fragmente über einen Röntgenfilm sichtbar gemacht werden. Spannung wird angelegt

46 ddA- Stücke ddT- Stücke ddC- Stücke ddG- Stücke Gelelektrophorese Auswertung Das kürzestes DNA-Stück läuft im Gel am Weitesten. Es hat als Abbruch-Base Cytosin. Die komplementäre Base des codogenen Stranges lautet also Guanin G Das um ein Nukleotid längere DNA-Stück läuft im Gel am Zweitweitesten. Es hat als Abbruch-Base Guanin. Die komplementäre Base des codogenen Stranges lautet also Cytosin. C usw. A T G T A G C G C T Da die Taq-Polymerase von 3 5 synthetisiert kann man nun auch die Polarität der DNA direkt angeben. 3` 5`

47 ddA- Stücke ddT- Stücke ddC- Stücke ddG- Stücke Gelelektrophorese Häufig wird eine andere Art der Darstellung gewählt. Dabei verbindet man die einzelnen Basen mit Linien untereinander und speichert die dabei erhaltenen Kurvenverläufe als Kennlinie der gesuchten DNA-Sequenz ab.


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