Physikalische Grundlagen der Messmethoden der Zell- und molekularen Diagnostik Hydrodynamische Trennungsverfahren Péter Maróti Professor für Biophysik,

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1 Physikalische Grundlagen der Messmethoden der Zell- und molekularen Diagnostik Hydrodynamische Trennungsverfahren Péter Maróti Professor für Biophysik, Universität von Szeged, Ungarn. Lehrbücher: Biophysik für Mediziner (Herausgeber S. Damjanovich, J. Fidy und J. Szöllősi) Medicina, Budapest, 2008. Fercher A.F. Medizinische Physik, Springer, Wien, New York 1992. Haas U.: Physik für Pharmazeuten und Mediziner; Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH. Suttgart 2002. Adam G., Läuger P. und Stark G.: Physikalische Chemie und Biophysik; Springer Verlag Berlin 1988 Beier W.: Biophysik; VEB Georg Thieme Leipzig 1975 Maróti P., Laczkó G.: Bevezetés a biofizikába, JATEPress, Szeged 1998 (Ungarisch) P. Maróti, L. Berkes, F. Tölgyesi: Biophysics Problems. A Textbook with Answers. Akadémiai Kiadó, Budapest 1998 (Englisch). P. Maróti: Lasers in Biophysics, Szeged 2012 (Englisch)

2 Sedimentation; Analytische Ultrazentrifugation

3 Sedimentation: Verschiebung von Teilchen (Molekülen) aufgrund von Kräften, die der Teilchen(Molekülen)masse proportional sind. Anwendungen der Sedimentationserscheinungen in Zellbiologie und molekularen Biologie Auftrennung (Separation) gemischter Teilchenpopulationen Charakterisierung von reinen Teilchenpräparationen nach - Größe - Form und - Dichte der Teilchen Große Kräfte zur Auftrennung können mit Hochgeschwindigkeits- bzw. Ultra- zentrifugen erreicht werden. Die Ultrazentrifugen rotieren sehr schnell - bis zu 500.000-mal in der Minute und die Beschleunigungen, die die Teilchen erfahren, können bis zu 10 6 g (Million-mal der Schwerebeschleunigung) erzeugt werden.

4 Verschiedene Rotortypen Schwenkbecher- rotor Vertikalrotor Festwinkelrotor Die Lage der Partikelbande während Rotation Die Reorientierung der Banden mit den Gradienten nach Stillstand der Rotoren Auftrennung der verschiedenen Teilchen in Banden

5 Schicht von Lösungsmittel (Wasser) gebunden durch Hydrodynamik Hydrodynamische Parameter der Molekülen Größe, Form, Molmasse und Dichte des Teilchens kann man bestimmen. Bewegung Stromlinien des Mediums 1. Das spezifische Volumen: Kehrwert der Dichte des anhydrischen Makromoleküls P, V’ P = Volumen/Masse, [V P ] = mL/g. Teilchen Eiweiße: V’ P ~ 0,7 – 0,75 mL/g Na + DNA: V’ DNA ~ 0,5 – 0,53 mL/g 2. Das partielle spezifische Volumen: Eiweiße: V P ~ 0,7 – 0,75 mL/g Na + DNA: V DNA ~ 0,5 – 0,53 mL/g Wir werden V’ P ≈ V P annehmen. Änderung in Volumen per Masse

6 3. Effektive (wirksame) Masse: die redizierte Masse des Teilchens unter Berücksichtigung des Auftriebs (aufgrund der Verdrängung des Volumens an Suspension der Dichte ρ) Für eine binäre Mischung aus makromolekularer Komponente (1 = P) und dem Lösungsmittel Wasser (2 = L) Hier sind m P und m L die in der Lösung des Volumen V enthaltenen Massen der Komponenten P bzw. L, die natürlich additiv die Gesamtmasse m t = m P + m L ergeben. Durch Division des Gesamtvolumens V mit der Gesamtmasse m t, erhalten wir Gibbs-Duham Formel wobei V das partielle spezifische Volumen der Lösung und χ P bzw. χ L die Massenbrüche der Komponenten P bzw. L darstellen. Volumen Masse des verdrängten Wassers P ρ

7 4. Hydration: Das Makromolekül umgibt sich mit einer Hydrathülle und wird als hydrotisiertes (oder aquatisiertes) Partikel bezeichnet. Die Masse des hydratisierten Teilchens Das Volumen des hydratisierten Eiweißes per Gramm Eiweiß = das partielle spezifische Volumen Die Hydrathülle um das Partikel modifiziert (erhöht) die Werte der Masse und des spezifischen Volumens des Teilchens beobachtet durch hydrodynamische Methode. P H2OH2O

8 Hydrodynamische Eigenschaften einiger Eiweiße ProteinM P (kDa) V P (mL/Gramm) δ H2O (Gramm H 2 O/Gramm Protein) R s /R min Ribonuclease13,6830,7280,591,14 β-Lactogobulin350,7510,611,25 Serumalbumin650,7310,751,31 Hämoglobin680,7490,691,14 Katalase2500,731,25 Tropomyosin930,74203,22 Fibrinogen3300,7410,12,34 Kollagen3450,6954606,8 Myosin4930,728863,53 R S : Stokes-sches Radius (gemesst) R min : Stokes-sches Radius ohne Hydrathülle (berechnet aus M P und V P ) Die Abweichung kommt aus Hydratationnicht KugelformBeide

9 1. Sedimentation im Schwerefeld der Erde Schwerkraft: Auftriebskraft: Reibungskraft: gleichmäßige Endgeschwindigkeit Die Reibungskraft kompensiert gerade die wirksame Schwerkraft (Gewicht Minus Auftriebskraft) beim Absinken des Teilchens mit konstanter Geschwindigkeit: unter Verwendung der Stokes- schen Reibungsformel für makroskopisches kugelförmiges Teilchen des Radius R s und Volumen Die Sedimentationsgeschwindigkeit des Teilchens im Erdschwerefeld beträgt: m P : Masse, V P : Volumen und ρ P : Dichte des Teilchens ρ: Dichte und η: Viskosität des Suspensionsmediums g: Schwerebeschleunigung der Erde v RsRs

10 Sedimentationsgeschwindigkeiten von Zellen in Erdschwerefeld Unter physiologischen Bedingungen haben Säugetierzellen Radien:2,5 μm < R s < 12 μm Dichten:1,05 g/cm 3 < ρ P < 1,10 g/cm 3 Die Geschwindigkeit v kann um einen Faktor 2 20 variiren. (ρ = 1,0 g/cm 3 ) Beispiel: Für 3T3-Mausfibroblasten (R s = 10 μm und ρ P = 1,05 g/cm 3 ) bei Sedimentation im Medium der Dichte ρ = 1,00 g/cm 3 und der Viskosität η = 1·10 -3 kg·m -1 ·s -1 ergibt sich Sedimentationsgeschwindigkeit v ≈ 1 mm/min = 6 cm/Std. Das ist eine experimentell durchaus brauchbare Sedimentationsgeschwindigkeit. Anwendung: präparative Auftrennung von Lymphocytenpopulationen. Größere Teilchen sedimentieren sehr viel schneller: Sephadex-Kügelchen (R s ≈ 100 μm) für Säulenchromatographie in Sekunden bis Minuten. Kleinere Teilchen wie Proteine (R s ≈ 5 nm) zeigen dagegen im Erdschwerefeld praktisch keine Sedimentation. Unterschiede der Zellsedimentation im Schwerefeld beruhen im wesentlichen auf Größenunterschieden der Zellen.

11 2. Sedimentationsgleichgewicht im Zentrifugalfeld Die Grundlage: optische Beobachtung der Verteilung der Teilchen (Makromoleküle) in dem Zentrifugalfeld hochtouriger Ultrazentrifugen, das Beschleunigungen (r · ω 2 ) mehrfachen der Gravitationsbeschleunigung (g) hervorbringt (r·ω 2 >> g). Im Sedimentationsgleichgewicht sedimentiert durch die Zentrifugalwirkung ebensoviel des gelösten Stoffes wie entsprechend der Diffusion zurückwandert. Mit (freier) Energie ausgedrückt: die freie Energie des Stoffes der Konzentration c ist Entropische Energie: Diffusion Potentielle Energie im Zentrifugalfeld M P Molmasse des Partikels Partielles spezifisches Volumen des Partikels (Kehrwert der Dichte) sollte die gleiche Größe überall haben, d.h. ist unabhängig von r : 2.1 Das Suspensionsmedium bleibt homogen, d.h. nimmt an der Sedimentation nicht teil.

12 r a Hieraus ergibt sich Diese Gleichung kann zwischen zwei Positionen a und r in der Zentrifugenzelle integriert werden: r 2 – a 2 ln c(r) ln c(a) Durch Messung der Konzentration entlang der Zentrifugenzelle sowie der Dichte des Lösungsmittels ρ, des partiellen spezifischen Volumens des Teilchens und der Kreisfrequenz der Zentrifuge ω ergibt sich also die Molmasse M P des Partikels. Steigung ~ M P Bei diesem Verfahren spielt der Diffusionskoeffizient (Reibungskonstante) keine Rolle weil es sich um Gleichgewicht (und um keine Dynamik (Bewegung)) handelt. Bei sehr hoher Winkelgeschwindigkeit ω des Rotors kann der Gleichgewichtszustand durch den partikelfreien Überstand und das Partikelsediment am distalen Teil (am Boden) der Zentrifugalzelle gegeben sein. Man kann jedoch eine niedrigere Winkelgeschwindigkeit wählen, bei der sich eine räumlich kontinuierliche Konzentrationsverteilung der makromolekularen Komponente einstellt. (1)

13 Sedimentationsgleichgewicht mit analytischer Ultracentrifuge Biochemistry (2001) 40, 3912-3919 Messung c(r) gegen r mit optischem Method. Man braucht klares Material. Beispiel: Alkyl hydroxyperoxide reductase (AhpF/AhpC complex) aus S. typhimurium Hintergrund: Rekombinant Heterodimer wurde hergestellt zur Untersuchung der Eigenschaften des Elektrontransfers. Das Heterodimer besteht aus zwei Einheiten: AhpF (Molmasse 34 kDa) und AhpC (Molmasse 55 kDa), die man aus E. coli genetisch produzieren kann (co-Expression). Frage: wie groß ist die Molmasse des isolierten Komplex mit enzymatischer Aktivität? Versuchsgerät: Beckman Optima analytische Ultracentrufuge. Die optische Absorption bei 280 nm kann man im Zentrifugenrörchen direkt messen. Bedingungen: verschiedene Protein Konzentrationen zwischen 3 und 34 μM Zellvolumen: 115 μL Partielle spezifisches Volumen: V P = 0.743 mL/g (berechnet) Dichte der Lösungsmittel: ρ = 1,0058 g/mL (gemeßt) Temperatur: 20 o C Drehzahle des Rotors: 8.000, 9.500 und 14.000 rpm Sammeln der Data (Messung): 8, 10 und 12 Std bei jeder Drehzahl

14 Sedimentationsgleichgewicht von Alkyl Hydroxyperoxide Reductase (AhpF/AhpC complex) Heterodimer 8.000 rpm 9.500 rpm 14.000 rpm Result: M P = 86,200 ± 200 Schlußfolgerung: das Enzym besteht aus einer-einer Kopie beider Einheiten von AhpF (Molmasse 34 kDa) und AhpC (Molmasse 55 kDa). Nach Gl. (1) Die linke Seite kann man umformen Nach Einsetzung Steigung der Kurve Klare Abweichung vom Gerade, weil V P nicht Konstante ist. Optische Dichte (Absorption) bei 280 nm

15 Sedimentationsgleichgewicht im Zentrifugalfeld 2.2 Zentrifugation im Dichtegradienten Bei diesem Verfahren verwenden wir präformierten Gradienten des Suspensionsmediums, deren Dichten ρ(r) die Partikeldichte (genauer: ihr reziprokes partielles spezifisches Volumen) einschließen. Die zentrifugierten Teilchen werden bei einer bestimmten Position r 0 im Gradienten zur Ruhe kommen. Man nennt diese Dichte ρ(r 0 ) die Schwebedichte oder auch (weniger treffend) die Schwimmdichte (engl. buoyant density) der makromolekularen Partikel. Die Form des Dichtegradienten soll in der Nähe der Gleichgewichtsposition (oder sogar im ganzen Bereich) als lineare Funktion in r beschrieben werden: wobei α =(dρ/dr) die (konstante) Steigung des Gradienten angibt. Setzen wir diese spezielle Ortsabhängigkeit der Dichte des Mediums in Gl. (1) ein:

16 Nach Vereinfachung nach Trennung der unabhängigen (r) und abhängigen (c) Veränderlichen zu beiden Seiten der Gleichung und nach Integration wobei Es ergibt sich eine Gauß-Verteilung der makromolekularen Konzentration mit bestimmter Bandbreite σ in der Nähe von r 0. Die Bande ist um so schärfer, je höher die Molmasse M P der Makromoleküle und die Zentrifugalbeschleunigung ω 2 r sind. Weiterhin wird die Schärfe der Bande von der Steilheit α des Dichtegradienten bestimmt. Vergleich der Einstellzeiten: Das Sedimentationsgleichgewicht ist viel schneller (in wenigen Stunden) erreicht als das Gradientengleichgewichtes (in Tagen). Daher werden praktisch brauchbare Trennungen auch schon bei nicht vollständig ins Gleichgewicht gekommenen Gradienten erzielt.

17 3. Sedimentationsgeschwindigkeit im Zentrifugalfeld Die Zentrifugenzelle wird mit einer homogenen Suspension gleich großer Partikel gefüllt. Nach Einschalten der Zentrifuge wird die Teilchensuspension mit konstanter Winkelgeschwindigkeit ω auf einer Kreisbahn bewegt und eine stationäre Sedimentationsgeschwindigkeit v wird sehr schnell erreicht charakterisiert durch das Kraftgleichgewicht:.... ω r wirksame Masse des Teilchens Zentrifugal- beschleuni- gung ReibungswiderstandZentrifugalkraft MPMP Nach Umordnung faßt man die experimentell unmittelbar zugängliche Größe Sedimentationskoeffizient S = Sedimentationsgeschwindigkeit Zentrifugalbeschleunigung

18 Die Sedimentationskoeffizient hängt von drei, experimetell und theoretisch zugänglichen Größen ab: Molmasse des TeilchensKehrwert der Dichte des Teilchens Reibungskoeffizient: Form (Gestalt) des Teilchens Einheit: s (Sekunde) Da in praktischen Anwendungen meist sehr kleine S-Werte (von den Größenordnung 10 -13 s) auftreten, benutzt man die praktische Einheit 1 Svedberg = 10 -13 s. Man kann aus unabhängigen Messungen (Gel Filtration, Diffusion usw.) bekommen. Bei kugelförmigem Teilchen f = 6 π η R s (Stokes’sches Gesetz) Man kann messen oder berechnen (z.B. aus der Reihenfolge der Aminosäuren). Bei Proteinen V P ≈ 0,75 mL/g Für Proteine findet man Sedimentationskoeffizienten zwischen 1 und 100 S. Für Zellorganellen ergeben sich (ihrer Größe entsprechend) wesentlich höhere Werte: Glycogen ≤ 10 5 S, Mitochondrien (1...7)·10 4 S, Kerne (1...10)·10 6 S, ganze Zellen (1...10)·10 7 S

19 Messung von S mit analytischer Ultracentrifuge: Wanderung der Grenze Die Suspension soll anfänglich homogen sein. Im Verlaufe des Sedimentations- vorganges bildet sich vom Meniskus der Füllung der Zentrifugenzelle ausgehend ein Bereich teilchenfreier Lösung heraus. Die Grenze zwischen diesem Bereich und der restlichen Teilchensuspension in Abstand r kann (z.B. schlierenoptisch) sichtbar gemacht werden. Die zentrifugale Wanderung dieser Grenze kann während der Zentrifugation kontinuierlich zeitlich verfolgt werden. Nach der Definition von S: und Integration beider Seiten:, Separation der Veränderlichen: wobei r und r 0 die Positionen der Grenze zu den Zentrifugationszeiten t bzw. t 0 sind. Die graphische Auftragung der experimentellen Daten ln (r) gegen ω 2 t sollte eine Gerade ergeben, t0t0 t ln r 0 ln r Rotationsachse t0t0 t r0r0 r Wanderung der Grenze und deren Steigung läßt sich der Sedimentations- koeffizienten S unmittelbar entnehmen.

20 Präparation von zellulären Partikelfraktionen : Waschen (Reinigung) der groben Sedimente Nach Homogenisierung eines Gewebes durch Zerreiben oder Zerschlagen und Aufschwemmung in einer physiologischen Pufferlösung unterwirft man das Homogenat sukzessiven Zentrifugationsschritten mit zunehmender Zentrifugalbeschleunigung. Bei jedem Schritt trennt man sorgfältig (durch Absaugen oder Dekantieren) den Überstand vom Sediment. Abschätzung der notwendigen Zeiten zur Sedimentation bestimmter Partikel aus einem Zellhomogenat. Die maximale Sedimentationszeit t max benötigen diejenigen Teilchen, die vom oberen Meniskus bei r = r a bis zum Boden bei r = r e des Zentrifugenröhrchens wandern müssen Mit dieser Gleichung kann man beispielweise die Sedimentationszeit kugelförmiger Teilchen des Radius R s berechnen; für diese ist V P = 4πR s 3 /3 und f = 6πηR s :

21 Diese Gleichung ist recht brauchbar, weil eine Kugelgestalt in sehr vielen Fällen wenigstens näherungsweise vorausgesetzt werden kann. Ribosomen (R s ≈ 8 nm, ρ P = 1,6 g/cm 3 ) benötigen in einem Sedimentationsmedium der Dichte ρ = 1 g/cm 3 und der Viskosität η = 0,001 kg·m -1 · s -1 für die Sedimentation von r a = 5 cm bis r e = 10 cm bei ω/2π = 30.000 min -1 eine Zeit t max = 8.230 s ≈ 2,3 Std. Durch Vergleich solcher Rechnungen für Fraktionen von Partikeln verschiedener Größe und Anteile dieser Fraktionen in verschiedenen Bereichen des Sedimentationsraumes kann man auch das Ausmaß möglicher gegenseitiger Kontaminationen der Fraktionen bei verschiedenen g- Werten und Zeiten abschätzen. Beispiel:

22 Beispiel: Messung des S-Wertes von GlpF, Glycerol Transport Facilitator protein aus E. coli Empirische Korrelation der S Werte von verschiedenen wasserlöslichen Protein Standard aufgrund der Sedimentationsgeschwindigkeiten in 5-20% Sucrose Dichtegradient. Zur Beachtung: weder  noch f sind Konstante. Die verschiedene Proteine haben verschiedene hydrodynamische Parameter. M P (1-V P  ) f S = PNAS (2001) 98, 2888-2893 Nativ Tetramer relative distance moved Sedimentationskoeffizient, S (Svedberg) Zirückgelegter Abstand (rel. Einheit) mit Protein Standard

23 Standard Method zum Erhalten Molmasse der Makromoleküle Sedimentationsdaten für Proteine und Viren bei 20 o C VPVP MPMP S 0 20,W unendliche Verdünnung Temperatur 20 o Cin Wasser (Svedberg, 1/s)(cm 2 ·s -1 )(cm 3 ·g -1 )(g·mol -1 )

24 Sedimentationskoeffizient von DNA und BSA (Bovin Serum Albumin) Sedimentationskoeffizient in S DNA BSA Konzentration (g/100 cc) Die S-Werte von DNA hängen sehr stark von der Konzentration der Lösung ab. Deswegen das Method ist nicht äußerst geeignet zur Untersuchung von DNA.

25 Kombination von Sedimentation und Diffusion Vorteil: die Reibungskoeffizient fällt aus! Theoretically: der Stokes-Radius (R s ) kann man aus Translation- Diffusion Messungen bekommen. In Wirklichkeit aber Gel Filtration oder molekulare Kromatographie sind benutzt. Zwei Beispiele für Anwendung der Kombination von Sedimentation und Stokes Radius: Experimentelle Bestimmung von M P. Dichtegradient Sedimentations- gleichgewicht Einige Partikel kann man bloß aufgrund der Differenzen der S-Werte nicht separieren. „Zwei dimensionale” Auftrennung Differentiale Sedimentation Sediment

26 Beispiel 1. Dissoziation von Hämoglobin bei niedrigen pH 4 x Experiment: bei Übergang vom hohen zu niedrigen pH Wert nimmt die Molmasse M P ab. Erklärung: die TETRAMER Form von Hämoglobin dissoziert zu MONOMER (oder Mischung von DIMER) Formen. D S S/D S (Svedberg) D (10 7 cm 2 s -1 ) nimmt ab pH Abnehmende pH macht - den Sedimentationskoeffizient (S) kleiner und - den Diffusionskoeffizient (D) größer bzw. den Stokes Radius (R s ) kleiner. D ist umgekehrt proportional mit Rs und S ist linear proportional mit M P /R s. Das Verhältnis S/D ist linear proportional mit M P wenn V P eine Konstante ist.

27 Beispiel 2. Ausdehnung von BSA bei säurigen pH S D S/D S (Svedberg) pHnimmt ab M P bleibt unverändert während Säuern (Acidifikation) und nur der Stokes Radius ändert sich (nimmt zu). Stokes Radius nimmt zu D (10 7 cm 2 s -1 ) Die Änderungen sind sehr ähnlich: beide Proteinen bewegen sich (sedimentieren) viel langsamer bei niedrigem pH Wert aber die Ursachen sind völlig verschieden: Hämoglobin fällt zu Teilen, BSA dehnt sich aus.

28 Gel Chromatographie

29 Die Moleküle gelöster Stoffe werden aufgrund ihrer Größe (ihres hydrodynamischen Volumens) getrennt. Der Trennungseffekt beruht auf unterschiedlichen Diffusionsvolumina für unterschiedlich große Moleküle. Die porösen Polymere der stationären Phase erlauben kleineren Molekülen einzudringen, wodurch sich das ihnen zur Verfügung stehende Diffusionsvolumen vergrößert und sich somit die Retentionszeit verlängert. Kleine Moleküle werden demnach stärker zurückgehalten als große, denen nur Zwischenräume zwischen dem Polymergranulat zugänglich sind und die daher schneller durch die Säule fließen. Daher sind große Moleküle in den früheren Fraktionen des Eluats, während kleinere Moleküle später eluieren. Polymer Partikel des Gels Kleinere Moleküle treten den wässrigen Innenraum des Partikels ein. Größere Moleküle können können nicht eindringen, sie bleiben außen. Andere (trennende) Moleküle

30 Geschwindigkeit des Partikels Geschwindigkeit des Lösungsmittels Lösungsmittelfluß V o V e V i Elutionsvolumen V e - V o V i - V o  = Partikel in der stationären Phase des Matrix Gleichgewicht von zwei Effekten (Kräften): - Lösungsmittelfluß und - Partition in die stationären Phase des Gelpartikels V o = Elutionsvolumen der völlig ausgedrängten Moleküle V i = Elutionsvolumen der völlig aufgenommenen Moleküle Wir müssen die Elutionsvolumen messen; V e, oder  Das erhaltene Elutionsvolumen liegt zwischen zwei Grenzen oder

31 σ ist das Maß wie der Innenraum des Gelpartikels für das untersuchten Molekül zugänglich ist  hängt von der Größe und Gestalt des Moleküls ab Kleines Molekül Großes Molekül   0.9   0.1 Zugängliches Volumen im Matrix V e - V o V i - V o  = Volumen des Innenraumes des Gelpartikels Das Elutionsvolumen bzw. σ bestimmt den Stokes Radius des Makromoleküls. Bei Eichung der Gel Chromatographie, die Standarde werden lieber nach Molmassen als nach Stokes Radii ausgewählt. Die Gestalt und das spezifische Volumen des geprüften Moleküls soll mit der Form und dem spezifischen Volumen der Standarde übereinstimmen.

32 Beispiel: Elution kugelförmiger Proteine mit Sephadex G-200 Wenn die Standarde und die unbekannte Makromoleküle die selbe Gestalt haben, dann – und nur dann – die Gel Filtration Chromatographie gibt gute Schätzung der Molmasse. Allerleie Abweichungen von der Kugelform resultieren größeren Stokes Radius, d.h. wir bekommen den Maximum Wert des Stokes Radius mit diesem Method. Sucrose V i 10 4 10 5 10 6 3.0 2.5 2 1.5 1.0 VeVoVeVo  Dextran blau V o 1010 cyt c BSA Katalase log (Molmasse) In Experimenten, die Retardation des Makromoleküls in Gel Filtration Chromatographie zeigt ausgezeichnete Korrelation mit dem Stokes Radius bestimmt mit Hilfe der Diffusion. völlig aufgenommen völlig ausgeschlossen globulare (kugelförmige) Proteine

33 Beispiel: Activer Transport mit Hilfe von außen Membran Proteinen und TonB in E. coli Science (1998)282,2202- FhuA Transport Protein Das aktive Transportsystem ist zum TonB gekoppelt. Erforderlich zum Ferric Ion Transport durch Ferrichrome Komplex TonB Das TonB Protein ohne das N-Terminal Membrane Anchor wird ausgedrückt und karakterisiert: ein His-tag am N-Terminus begünstigt die Isolation and Reinigung von H6-’TonB in einem einziegen Schritt. Das erhaltene Protein ist wasserlöslich und die berechnete Molmasse beträgt M P ≈ 24.880

34 Journal of Bacteriology, May 2001, p. 2755-2764, Vol. 183, No. 9 Gel (Size Exclusion) Chromatographie von H 6 -TonB mit Superose 12 Säule Totales Volumen: V i = 21 ml gemesst durch Elution von NaNO 3 Verdrängtes (Void) Volumen: V 0 = 7,3 ml gemesst durch Elution von Dextran blau 2000 Kalibration (Eichung) gegen R s Thyroglobulin R s = 8.6 nm; V e = 8.8 ml FerritinR s = 6.3 nm; V e = 10.7 ml Katalase R s = 5.2 nm; V e = 11.7 ml Aldolase R s = 4.6 nm; V e = 12.0 ml Bovine Serum Albumin R s = 3.5 nm; V e = 12.5 ml Ovalbumin R s = 2.8 nm; V e = 13.4 ml Chymotrypsinogen R s = 2.1 nm; V e = 14.9 ml RNase R s = 1.75 nm; V e = 15.5 ml Experimentelle Resultate R s = 4,1 nm

35 Sedimentations- geschwindigkeit Messung: S 20,w = 1.4 S Berechnung von M P  = 1.007 g/ml  = 1.04 Poise V = 0.7376 ml/g (aus Sequence) R s = 4.1 nm (aus Gel Filtration) R s = M P (1 - V  )/6  NS 20,w H 6 -TonB bildet Monomer in Lösung H 6 -TonB Sedimentations- gleichgewicht M P = 30.000 M P = 28.000 0.8 mg/ml Protein 18.000 rpm in der Nacht bei 20 o C Steigung = M P (1-V  )  = 1.007 g/ml V = 0.7376 ml/g Gel Chromatographie R s = 4,1 nm Berechnung R min = (3M P V/4  N) 1/3 = 1,9 nm (Kugel ohne Hidration mit M P = 24.900 (Sequence) Das Molekül ist äußerst asymmetrisch R s /R min = 2.1 Schlußfolgerung:

36 R min = 2.0 nm R s /R min = 2 Das entspricht zu einem Drehellipsoid mit Axialverhältnis von 15:1 240 Å x 16 Å Gestalt des Proteins TonB mit der Annahme von 0,3 Gramm H 2 O/Gramm Protein Hydration TonB wandert aus der inneren (zytoplasmischen) Membran (CM) zu der äußeren Membran (OM) im periplasmischen Bereich (PP) des Bakteriums.

37 Elektrophorese

38 Negativ geladene Moleküle (Anionen) wandern zur positiv geladenen Anode und positiv geladene Moleküle (Kationen) wandern zur negativ geladenen Kathode. Wanderungsrichtungen der Ionen Gleichspannung, U Elektrophorese bezeichnet die Wanderung großer elektrisch geladener Teilchen (Proteine, ganze Zellen) durch einen als Trägermaterial dienenden Stoff unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes. Die Wanderungsgeschwindigkeiten verschiedener Ionen hängen von deren Ladung, Form und effektiver Größe sowie von der Lösungsumgebung und von der Stärke des elektrischen Feldes ab. 1) Die einfachste (naivste) Beschreibung: Wenn die auf die Teilchen wirkende Kraft q · E (q = e ⋅ z, wobei z ist die Anzahl der Ladungen an einem Molekül, E = U/d ist die Feldstärke) gleich der Reibungskraft f·v ist, beobachtet man eine konstante Wanderungs-geschwindigkeit v = q · E/f. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist somit proportional der angelegten Spannung. Als charakteristische Grösse für die Mobilität des Moleküls führt man die elektrophoretische Beweglichkeit ein: d μ = Wanderungsgeschwindigkeit Elektrische Feldstärke q f =

39 Der Reibungskoeffizient f hängt sowohl von der Masse und der Form des wandernden Moleküls als auch von der Viskosität des umgebenden Mediums ab. Beispiel: Das Protein Albumin hat eine elektrophoretische Beweglichkeit von μ = 4·10 -9 m 2 V -1 s -1 bei pH = 4. Mit einer Spannung U = 2000 V und einer Laufstrecke von d = 20 cm ergibt sich hieraus eine Wanderungsgeschwindigkeit von v = 4·10 -5 m s -1 = 14,4 cm h -1 auf dem Gel. 2) Eine bessere Beschreibung. Die exakte Berechnung von elektrophoretischen Beweglichkeiten ist komplizierter, da - der effektive Wert der elektrischen Ladung eines wandernden Moleküls (q) von seinem hydrodynamischen Verhalten und seinen Solvatationsbedingungen abhängt, - die genaue Form des Moleküls unbekannt ist und - das Teilchen und die (entgegengesetzt geladene) Ionenwolke in entgegengesetzten Richtungen und mit verschiedenen Geschindigkeiten (v und v’) wandern. Die Ionenwolke wird an der Vorderseite des Teilchens ständig wieder neu gebildet. Auf dieser Weise kommt es zu einer zusätzlichen hydrodynamischen Bremsung des Teilchens duch die umgebende Ionenwolke dessen Radius ist durch die Debye-Länge (λ D ) gegeben. η: Viskosität des Mediums, σ E : „elektrophoretisch wirksame” Ladungsdichte auf der Teilchenoberfläche. Beweglichkeit

40 Elektrophoretische Beweglichkeit Wenn der kleinste Krümmungsradius des Teilchens größer ist als die Dicke λ D der Ionenwolke (diffuse Doppelschicht), dann Die elektrophoretische Beweglichkeit ist i) proportional zu „elektrophoretisch wirksame” Ladungsdichte auf der Teilchenoberfläche σ E, ii) umgekehrt proportional zur Viskosität η des Mediums und iii) wächst linear mit der Debye-Länge λ D an. Ad iii) Das erklärt sich daraus, daß bei kleinem λ D, d.h. bei eng dem Teilchen anliegender Ionenwolke die hydrodynamische Bremsung (die „extra Kraft”) groß wird. Ad i) Im allgemeinen ist σ E verschieden von der eigentlichen Ladungsdichte σ des Teilchens. Dies hängt u.a. damit zusammen, daß wegen Oberflächenrauhigkeiten ein Teil der Gegenionen bei der Wanderung des teilchens mitgeschleppt wird, wodurch der Absolutbetrag der wirksamen Ladungsdichte verkleinert wird. Die Beweglichkeit kann man auch mit dem Zeta-Potential ausdrücken:

41 Physikochemischer Hintergrund: Ionen in Coulombscher Wechselwirkung Grundfrage: wie verteilen sich die Ionen um eine Elektrode oder um ein ausgewähltes (Zentral)ion? 2) Räumliche Verteilung der Ionen. Obwohl die Ionen in der Lösung sich gleichmäßig verteilen (siehe die Abbildung), die Verteilung wird nicht mehr gleichmäßig in der direkten Umgebung des ausgewählten Ions (Elektrode) bleiben, worauf die thermische Bewegung zu einer stärkeren Verteilung der Ionen führt. Die elektrisch geladene Lösungsmittelmoleküle und Ionen der Elektrolyt stehen in Wechselwirkung miteinander kontrolliert duch das Coulombsche Gesetz der Elektrostatik. Jedes Ion befindet sich im Zentrum einer Wolke aus entgegengesetzt geladenen Ionen (durch Kreise angedeutet). Nachfolgen: 1) Abschirmung der elektrostatische Wirkung der Ionen (Elektrode). Die Ionenwolken (und die Lösungsmittelmoleküle) als Dielektrikum schwächen die Coulombschen Wechselwirkungen ab und schirmen die Ladung des Ions (Elektrode) ab. Die karakteristische Länge der Abschirmung (Debye- Länge λ D ) wird als Radius der Ionenwolke betrachtet. ℓDℓD

42 Ionenverteilung um eine Elektrode in Elektrolytlösung

43 Ionenverteilung um ein zentrales Partikel in Lösung Positiv geladenes Gegenion Negativ geladenes Co-Ion Negativ geladenes Zentralion Stern Doppelschicht mit fest gehaltenen Gegenionen Diffuse Schicht mit frei beweglichen Ionen Ions im Gleichgewicht mit der Lösung Schubebene Debye-Länge

44 Grundfrage: Wie verteilen sich die Ionen um eine geladene Platte (Elektrode)? Grundidee: zwei gegenläufig Prozesse Das elektrostatische Feld der Elektrode (oder zentrales Ions) zieht entgegengesetzt geladene Ionen an Die Molekularbewegung zerstört immer wieder jede Ordnung Gouy-Chapman-Modell Das elektrische Potential φ(x) hängt von der Ladungsdichte ρ(x) selbst ab: Trotz aller Kompliziertheit: näherungsweise ist die Lösung der Gleichungen rein exponentiell: mit der Debye-Länge: Poisson-sche Gleichung abgeleitet aus dem Gauss- schen Gesetz der Elektrostatik Abstand, x [nm] Potential, φ [mV] I:I: λDλD N A : Avogadro Konstante e: elementare Ladung ε: Dielektrizitätskonstante kT: Boltzmann Faktor I: Ionenstärke der Lösung: c i : Konzentrationen der Ionensorten in der Lösung z i : Ladungszahlen der Ionensorten

45 Gouy-Chapman-Modell Zusammenhang zwischen Flächenladungsdichte σ und Grenzflächenpotential φ 0 Analogie zwischen einem Plattenkondensator und einer elektrischen Doppelschicht Die für einen Plattenkondensator gültige Beziehung zwischen Feldstärke E und Ladungsdichte σ Kann auf die Doppelschicht übertragen werden, sofern E = -d φ /dx die Feldstärke unmittelbar an der Wand (x = 0) eingesetzt wird: Der exponentielle Verlauf des Potentials ist schon bekannt: und die gesuchte Beziehung lautet: oder Zeta-Potential

46 Trägermaterials Die verschiedene Trägermaterials meist gequollene Gele aus Agarose oder Polyacrylamid führen zu unterschiedlichen Ionen-beweglichkeiten. Die Polymermoleküle des Gels bilden ein mehr oder weniger engmaschiges, dreidimensionales Netzwerk. Agarose-Gele sind relativ groß-porig (150 nm bei 1% und 500 nm bei 0,16 % Gelen). Gele aus Polyacrylamid werden durch Poly- merisation von Acrylamid hergestellt. Sie weisen wesentlich kleinere Poren auf (3–6 nm). Die Porengröße hängt von der Acrylamid- konzentration und dem Vernetzungsgrad ab.

47 Schema der Herstellung des Polyacrylamid Gels aus ungeordneter (random) Struktur. Übergang aus verdünnter Polymer Lösung (A) durch konzentrierte Lösung (B) zu Gel (C). --o– Punkt für Kreuzverbindung --●-- Punkt für Anschluß Schematische Darstellung einer Protein-Aufreinigung analysiert mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Proteinlösung Richtung der Wanderung Unbekanntes ProteinMolmasse Standarde

48 Anwendungen: 1. Blutbild, Elektrophorese von Blut Serum- proteinen, diagnostische Aussagemöglichkeiten Die Untersuchung der Serumproteine ist bei chronisch-entzündlichen Erkrankungen, Verdacht auf monoklonale Gammopathie bzw. Plasmozytom und Verdacht auf Antikörpermangel (humoraler Immundefekt) wichtig.

49 Anwendungen: 2. Ferguson Analyse Empirisch wurde für die (relative) Beweglichkeit folgender Zusammenhang gefunden: mit μ 0, der elektrophoretischen Beweglichkeit ohne den zurückhaltenden Matrixeinfluss des Gels (c Gel = 0), K R bezeichnet die Retention durch Reibung und c Gel beschreibt die prozentige (%) Konzentration des Trägermaterials. μ 0 hängt vom q (Ladung) und Stokes Radius (Gestalt) des Moleküls ab. K R hängt nur vom Stokes Radius, aber nicht vom q ab. In den Ferguson-Plots wird dieser Zusammenhang graphisch ersichtlich. kleine Makromoleküle mit hoher Ladung log μ c Gel (%) 3 1 2 grosse Makromoleküle mit hoher Ladung und grosser Steigung kleine Makromoleküle mit geringer Ladung

50 Anwendungen der Ferguson Analyse : die Östrogenrezeptoren Östrogenrezeptoren sind Steroidrezeptoren, die durch das Steroidhormon Östrogen aktiviert werden. c Gel (%) log μ Stokes Radius, R s (nm) √KR√KR Markierung der Rezeptoren auf dem Gel durch Verbindungversuch mit radiomarkierten Östrogen Analogen. Gereinigtes Material ist nicht erforderlich. Die Molmasse M P aus Stokes Radius R s kann man nur mit Annahme der kugelförmigen Gestalt berechnen. SteigungKRKR KRKR RsRs ? MpMp

51 Anwendungen der Ferguson Analyse : SDS-Protein Komplexe Schematische Darstellung einer Micelle aus Peptidkette und SDS-Molekülen. Zum Trennmedium auf Plyacrylamidbasis kommt noch SDS (Natriumdodecylsulfat). Dieses anionische Tensid (Detergens) überdeckt die Eigenladungen von Proteinen. Pro Gramm Protein binden ungefähr 1,4 Gramm SDS, sodass die Proteine eine konstante negative Ladungsverteilung aufweisen. Die negativen Ladungen des SDS führen zu einer gegenseitigen Abstoßung, was zusammen mit der Denaturierung durch Aufkochen zu einer Linearisierung der Proteine führt. Dies erlaubt eine Auftrennung nach der Kettenlänge, proportional zur Molekülmasse, denn die längeren Proteine werden im Gel stärker zurückgehalten als kürzere Proteine. Das SDS umgibt das linearisierte Protein mit einer näherungsweise ellipsoiden Hülle. Die Eigenladungen der Proteine sind unter der SDS-Beladung vernachlässigbar. Vorteile: 1) Die verschiedene SDS-Protein Komplexe haben die gleiche Gestalt. Der selbe Zusammenhang ist gültig zwischen dem Stokes Radius R s und der Molmasse M P bei jedem Protein: K R in Ausdruck von Ferguson hängt von der Molmasse ab. 2) Größere Proteine bilden längere Komplexe mit mehr Ladungen (q) und größere Retention durch Reibung (f). Die Ladungen und Größe der SDS- Protein Komplexe ändern sich proportioniert. Die Änderungen von q und f werden im Verhältnis μ 0 = q/f ausgeglichen, deswegen μ 0 hängt nicht von der Molmasse ab. unabhängigabhängig von der Molmasse

52 log μ 0 1 5 10 % acrylamid Es reicht nur ein einzieges Gel zu benutzen um R s (mit Standarden) zu bekommen. SDS-PROTEIN KOMPLEXE 0 1 5 10 % acrylamid schnell langsam NATIVE PROTEINE Man kann R s aus einem Gel NICHT erhalten. Der Fixwert von μ 0 ermöglicht den Stokes Radius R s mit Gebrauch von einem Gel und Standarden zu bestimmen. Weil alle SDS-Protein Komplexe die gleiche Gestalt besitzen, aus dem Stokes Radius R s kann man die Molmasse M P erhalten. erhöhter Stokes Radius, R s verschiedene μ 0 Werte elektrophoretische Wanderung größere Steigung - erhöhter Stokes Radius, R s der gleiche μ 0 Wert Es ist nicht erforderlich die Gelkonzentration zu ändern.

53 Hausaufgaben 3) Wie lange dauert es, bis ein E. -coli Bakterium mit der Dichte 1,10 g/mL und dem Radius 1 μm unter der Einwirkung des Gravitationsfeldes der Erde in Wasser (Dichte 1 g/mL und Viskosität 1·10 -3 Ns/m 2 ) 1 cm sedimentiert? 1) In einer Zentrifuge befinde sich eine Suspension einheitlich kleiner Teilchen. Bei einer Rotationsfrequenz von 1 000 Hz beträgt ihre Sedimentations- geschwindigkeit 2 mm/min. Welchen Wert hat diese, bei Verdoppelung der Rotationsfrequenz? 2) In einer Zentrifuge rotiert eine kleine Masse im Abstand 9,8 cm um die Zentrifugenachse mit einer Winkelgeschwindigkeit 100 1/s. a)Wievielmal größer ist ungefähr die auf die Masse wirkende Radialbeschleunigung (Zentrifugalbeschleunigung) als die Fallbeschleunigung? b)Wie groß ist die Bahngeschwindigkeit der Masse?

54 M (Da)ρ (g/mL) Pepsin37 0001,33 Urease480 0001,37 5) Die relative Molekülmasse M und die Dichte ρ von Pepsin und Urease betragen Bestimmen Sie daraus den Radius r der sphärischen Makromoleküle unter Vernachlässigung der Hydration. Hausaufgaben 4) Bei der Sedimentation von Ribonuklease in einer Ultrazentrifuge wurde bei einer Drehfrequenz von 52.400 min -1 der Abstand r der Phasengrenze der sedimentierenden Moleküle in Abhängigkeit von der Zeit t gemessen: t (min)r (cm) 05,908 325,980 646,045 966,112 Berechnen Sie mit Hilfe dieser Meßwerte näherungsweise die Sedimentationskonstante S!

55 Hausaufgaben 6) In 0,25 M Sucroselösung werden Rattenleber-Mitochondrien suspendiert. Bei 0 o C hat diese Sucroselösung eine Dichte von 1,035 g/mL und eine Viskosität von 0,0231 g · cm -1 · s -1. Die Dichte der Mitochondrien in dieser Lösung bei 0 o C ist 1,100 g/mL. Wie lange muß man mindestens bei 0 o C und 8.000 min -1 Drehzahl zentrifugieren, damit die Mitochondrien vom oberen Meniskus (r a = 5 cm von der Rotationsachse) auf den Boden des Zentrifugenröhrchens (r e = 10 cm von der Rotationsachse) absinken? Die Mitochondrien können näherungsweise als kugelförmige Teilchen mit dem Radius 1 μm angesehen werden, die das Stokessche Reibungsgesetz befolgen.

56 Hausaufgaben 7) In einer KCl-Lösung sei in x-Richtung ein Konzentrationsgradient vorhanden. An der Stelle x betragen die KCl-Konzentration 0,1 M und der Konzentrationsgradient von KCl 1 M/cm. Wie groß mußte man am Ort x die elektrische Feldstärke machen, damit dort der Transport von K + verschwindet? 8) Wie groß ist die Ionenstärke einer Lösung, die 0,1 M NaCl und 0,1 M CaCl 2 enthält? 9a) Das Kulturmedium einer Zellkultur besitze einen pH-Wert von 7,0 und eine Ionenstärke von 0,1 M. Die Zelloberfläche ist negativ geladen mit der Ladungsdichte von einer Elementarladung pro 10 nm 2. Man berechne den pH-Wert an der Zelloberfläche! b) Unter diesen Bedingungen wird die elektrophoretische Beweglichkeit der Zellen gemessen. Welchen Weg legt eine Zelle einer Feldstärke von 10 V/cm in 1 min zurück? Man setze hier das elektrophoretische ζ-(Zeta)Potential näherungsweise dem Grenzflächenpotential φ 0 gleich. (Debye-Länge 1,0 nm, Dielektrizitätskonstante des Wassers 80, Dielektrizitätskonstante des Vakuums 8,85·10 -12 Cb·V -1 ·m -1, Elementarladung 1,6·10 -19 Cb, Viskosität des Mediums 1,0·10 -3 kg · m -1 · s -1, Temperatur 298 K.)