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Immunpräzipitation Praktikum I. Ablauf des Experiments Ablaufplan.

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Präsentation zum Thema: "Immunpräzipitation Praktikum I. Ablauf des Experiments Ablaufplan."—  Präsentation transkript:

1 Immunpräzipitation Praktikum I

2 Ablauf des Experiments Ablaufplan

3 1.1 Herstellen der Antikörper-Arbeitslösung Die AK-Stammlösung enthält 7,5 mg IgG/mL (Gesamtvolumen: 1mL) Pipettieren Sie 100 µL Antikörper-Stammlösung aus dem gelben Tube (AK-Stamm) in Ihr rotes Probetube (AK) Pipettieren Sie nun 900 µL NaCl-Lösung in das rote Tube (AK) Durchmischen Sie anschließend die Lösung durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren der Lösung Beim Durchmischen nur bis zum ersten Anschlag pipettieren, sonst entstehen Luftblasen! 1. Experimentvorbereitung

4 1.2 Herstellen der Antigen-Arbeitslösung Die Konzentration der AG-Stammlösung beträgt 50 mg/mL (Gesamtvolumen: 1 mL) Pipettieren Sie 40 µl aus dem violetten Tube (AG-Stamm) in das blaue Tube (AG) Pipettieren Sie nun 960 µL NaCl-Lösung in das blaue Tube (AG) Durchmischen Sie anschließend die Lösung durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren 1. Experimentvorbereitung

5 2.1 Pipettieren Sie in die Wells 1 – 7 jeweils 100 µl NaCl- Lösung. 2.2 Pipettieren Sie 200 µL AG-Arbeitslösung aus dem blauen Tube in Well µL AG 2. Ansetzen der Verdünnungsreihe

6 2.3 Pipettieren Sie 100 µL AG aus Well 8 in Well Durchmischen Sie den Inhalt von Well 7 durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren. Beim Durchmischen nur bis zum ersten Anschlag pipettieren, sonst entstehen Luftblasen! µL AG 2. Ansetzen der Verdünnungsreihe

7 2.5 Pipettieren Sie aus Well µL in Well Durchmischen Sie den Inhalt von Well 6 durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren. Verfahren Sie entsprechend bis zu Well Verwerfen Sie nun 100 µL aus Well µL µL verwerfen 2. Ansetzen der Verdünnungsreihe

8 2.8 Pipettieren Sie in alle Wells jeweils 100 µL AK aus dem roten Tube. 2.9 Inkubieren Sie Ihren Ansatz 5 Minuten bei Raumtemperatur. 2. Ansetzen der Verdünnungsreihe Welche AG-Konzentration liegt nun in den verschiedenen Wells vor?

9 Antikörper-Analytik Praktikum II

10 Bereiten Sie Ihre Tubes nach folgendem Pipettierschema vor. 1. Ansetzen der Proben für die PAGE

11 1.1 Pipettieren Sie aus dem grünen Tube (LÄ) jeweils 25 µL Lämmlipuffer in die Probentubes Pipettieren Sie jeweils 15 µL H 2 O in die Tubes 1, 2, 4, 5, 7 und 8, jeweils 5 µL H 2 O in die Tubes 3, 6 und Durchmischen Sie den Inhalt von Well 4 durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren. Pipettieren Sie aus Well 4 10 µL Präzipitat in die Probentubes 1, 2 und Pipettieren Sie aus dem roten Tube (AK) 10 µL Antikörper in die Probentubes 4, 5 und Ansetzen der Proben für die PAGE

12 1.4 Pipettieren Sie aus dem blauen Tube (AG) 10 µL Antigen in das Probentube 7, 8 und Pipettieren Sie aus dem gelben Tube (DTT) jeweils 10 µL Dithiotreitol in die Probentubes 3, 6 und Ansetzen der Proben für die PAGE

13 1.6 Stellen Sie die Probentubes 2, 3, 5, 6, 8 und 9 für 5 min bei 95° C in einen Heizblock. TubeHitzeDTT AK/AG AK AG Ansetzen der Proben für die PAGE

14 2. Vorbereiten der Gelkassette 2.1 Schneiden Sie die Verpackung des Fertiggels entlang der vorgegebenen Linie auf und entnehmen Sie die Gelkassette.

15 2.2 Schneiden Sie mit einem Skalpell die Klebefolie der Gelkassette entlang der markierten Linie ein und ziehen Sie den unteren Streifen ab. 2. Experimentvorbereitung

16 3.1 Setzen Sie die Gelkassette mit der kürzeren Platte nach innen gerichtet in den Elektrodenstand ein. Setzen Sie auf der gegenüberliegenden Seite eine weitere Gelkassette oder eine Blindplatte ein. 3.2 Drücken Sie den Elektrodenstand im Klammer- rahmen nach unten und schließen Sie die zwei Klemmklappen. 3.3Setzen Sie den Klammerrahmen mit dem Elektrodenstand in den Pufferbehälter ein. 3. Vorbereiten der Elektrophoresekammer

17 4.1Befüllen Sie den Elektrodenstand mit TGS-Puffer bis zum oberen Rand. 4.2Befüllen Sie den Pufferbehälter mit etwa 800 mL TGS-Puffer. 4.3Ziehen Sie den Kamm. (Einkerbung beachten!) 4. Befüllen der Kammer mit Puffer

18 Befüllen Sie die Geltaschen mit: - 20 µL aus Probentube (1) - 20 µL aus Probentube (2) - 20 µL aus Probentube (3) - 5 µLKaleidoskop-Längenstandard (KS) - 20 µL aus Probentube (4) - 20 µL aus Probentube (5) - 20 µL aus Probentube (6) - 20 µL aus Probentube (7) - 20 µL aus Probentube (8) - 20 µL aus Probentube (9) AKAGAK/AGKS 5. Befüllen der Geltaschen

19 6.1Schließen Sie die Gelkammer und starten Sie die Gelelektrophorese bei 150 V. 6.2Beenden Sie die Elektrophorese, wenn der Farbstoff den unteren Rand des Gels erreicht hat. 6. Durchführung der Elektrophorese

20 7.1Entnehmen Sie den Klammerrahmen und dekantieren Sie den Puffer in den Pufferbehälter ab. (Puffer ist wiederverwendbar!) 7.2Entnehmen Sie die Gelkassette aus dem Elektrodenstand. 7. Entnahme des Gels

21 8.1Lösen Sie die Glasplatten vom Gel und legen Sie dieses in eine Färbeschale. 8.2 Vor dem Färben das Gel 2 Minuten wässern, dann Wasser dekantieren. 8.3Färben Sie das Gel durch Zugabe von 100 mL Coomassie-Lösung maximal 30 Minuten. 8.4Gießen Sie anschließend die Coomassie-Lösung in die Vorratsflasche zurück und fügen Sie 100 mL lauwarmes Wasser hinzu. 8.5 Stellen Sie das Gel auf den Schüttler. 8. Proteinfärbung

22 Tab.: Molare Masse der Proteine im Kaleidoskop- Standard 9.1 Erstellen Sie eine Eichgerade mit Hilfe des Kaleidoskop-Standard. ProteinFarbeM MyosinBlau Da ß-GalactosidaseMagenta Da Rinderalbumin Grün Da KarbonanhydraseViolett Da Sojabohnen-Trypsin-InhibitorOrange Da LysozymRot Da AprotininBlau 7081 Da 9. Auswertung

23 9.2 Bestimmen Sie die molekularen Massen der Banden jeder Spur. Welche Bande gehört zu welchem Protein? 9. Auswertung


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